甲型流感病毒与NLRP3炎性小体激活的研究进展

潘文亮，江宁，王松，邱世昕

(福建农林大学动物科学学院(蜂学学院)/闽台动物病原生物学福建省高校重点实验室，福建 福州 350002)

甲型流感病毒(influenza A virus，IAV)长期以来对公共卫生安全和畜牧业造成了全球性的威胁，广泛地导致人类与畜禽的死亡，值得注意的是1918至1920年由H1N1病毒引起的“西班牙流感”大流行，据研究估计感染造成5千万至1亿人死亡；1957年的H2N2病毒造成超过200万人死亡，1968年的H3N2病毒杀死了约100万人[1-2]。禽类感染的甲型流感病毒H5N1和H7N9均可传染给人类，H5N1致死率在60%，H7N9致死率在20%左右，但是其相对于H5N1而言具有更高的传播速度[3]，所以阐释甲型流感病毒的致病机理在对其预防和治疗方面尤为重要。甲型流感病毒感染所引发的严重疾病和造成的死亡，与宿主体内异常或者失调的细胞因子、以及炎症反应有关[4]。细胞因子NOD样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)炎性小体是一种宿主天然免疫的蛋白复合物，其与病毒感染时大量促炎细胞因子分泌并造成细胞因子风暴，进而诱发过度炎症反应有密切的关联。本文阐述了 NLRP3 炎性小体在甲型流感病毒感染中的作用和现今研究发展，为甲型流感病毒感染引发的细胞因子风暴提供潜在的治疗方向。

1 甲型流感病毒

流感病毒属于正黏病毒科家族(Orthomyxoviridae)，分为甲、乙、丙、丁或A、B、C、D四型。甲型和乙型流感病毒为具有8个基因组片段的单链负股RNA病毒，编码10种必需的病毒蛋白，包含血凝素(hemagglutinin，HA)、神经氨酸酶(neuramidinase，NA)、核蛋白(nucleoprotein，NP)、非结构蛋白1(non-structural protein 1，NS1)、非结构蛋白2(nonstructural protein 2，NS2)、基质蛋白1(matrix protein 1，M1)、基质蛋白2(matrix protein 2，M2)、聚合酶碱性蛋白1(polymerase basic protein 1，PB1)、聚合酶碱性蛋白2(polymerase basic protein 2，PB2)和聚合酶酸性蛋白(polymerase acid protein，PA)，以及若干个辅助蛋白转录本，例如与病毒毒力密切相关的非结构蛋白PB1-F2蛋白等[5-6]。另外，丙型和丁型流感病毒的遗传物质由7个基因组片段组成，在病毒表面表达血凝素酯酶融合(hemagglutinin esterase fusion，HEF)蛋白来代替HA和NA[7]。其中，甲型流感病毒是导致人类以及畜禽流感大流行的主要病原，因此得到了广泛的研究。

甲型流感病毒基因组长约1.35万个碱基，由8个片段组成，能够编码10种必需的病毒蛋白，根据HA和NA蛋白的分子结构和遗传特征，在人类、畜禽等宿主中发现有16种HA亚型和9种NA亚型，且近年来在蝙蝠体内检测出H17N10和H18N11[8]。在一种甲型流感病毒与其他不同来源的流感病毒株共同感染情况下，可能会导致病毒抗原转移，从而产生全球暴发的新型流感病毒[9]。甲型流感病毒可感染宿主肺部的免疫细胞，例如巨噬细胞和树突状细胞，分泌一系列促炎细胞因子和趋化因子[10]，造成细胞因子风暴，其感染还能使得免疫细胞大量向肺部浸润，从而导致急性肺组织损伤引发急性呼吸窘迫综合征，且发病过程常常伴随细菌感染，严重危害宿主的生命安全[11]。甲型流感病毒具有突变能力强，传播速度快，对宿主的生命安全造成威胁等特点，所以对于此病毒的防治极其重要。

2 NLRP3炎性小体及其激活机制

NOD样受体(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors，NLRs)是一种胞内模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)，它可以识别多种病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)和损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)[12]。NLRP3是NOD样受体家族中重要的一员，其炎性小体复合物由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)和半胱天冬酶-1前体(pro-cysteinyl aspartate specific proteinase-1，pro-caspase-1)组成。NLRP3由冷诱导自身炎症综合征基因1(cold induced autoinflammatory syndrome 1，CIAS1)所编码，包含一个N末端的吡啶结构域(pyrin domain，PYD)、一个中央核苷酸结合寡聚结构域(nucleoside triphosphatase domain，NACTH domain)和一个C末端富含亮氨酸的重复序列(leucine-rich repeat，LRR)[13]。NLRP3感应到危险信号时，通过LRR使得其N末端的吡啶结构域PYD与ASC的PYD相互作用并结合，之后ASC通过自身的募集结构域(caspase activation and recruitment domain，CARD)来募集同样具有CARD的pro-caspase-1，从而聚集成NLRP3炎性小体[14]。激活的炎性小体可促使ASC将pro-caspase-1切割成具有活性的caspase-1，导致促炎细胞因子白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)和白介素18(interleukin-18，IL-18)的成熟与分泌，并诱导细胞死亡[15-16]。甲型流感病毒感染时会激活NLRP3炎性小体，这是宿主自身的一种先天防御手段，以执行抗病毒作用。然而，在严重感染患者中观察到，NLRP3炎性小体被过度激活，并造成大量的促炎细胞因子表达，进而引发细胞因子风暴造成肺组织损伤[11]，这也是甲型流感病毒感染造成宿主死亡的主要原因。

在甲型流感病毒感染期间，NLRP3炎性小体由两种危险信号来激活。第一危险信号为：Toll样受体3(Toll-like receptor 3，TLR3)、Toll样受体7(Toll-like receptor 7，TLR7)和维甲酸诱导基因I(retinoic acid-inducible gene-I，RIG-I)，识别病毒RNA，Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)可识别由于甲型流感病毒感染而表达量增加的高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein box-1，HMGB1)、然后激活核转录因子(nuclear factor-κB，NF-κB)，促使NLRP3、pro-caspase-1、ASC蛋白、pro-IL-1β和pro-IL-18的表达上调[17-18]。第二危险信号为：病毒引发的钾离子外流，溶酶体成熟和活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生，并促使NLRP3炎性小体的组装[19]。在甲型流感病毒的研究中观察到，其ssRNA、M2蛋白以及PB1-F2蛋白可激活NLRP3炎性小体[20-24]，而NS1蛋白能够抑制NLRP3炎性小体的第一危险信号和第二危险信号，从而抑制NLRP3炎性小体的形成[25-27]。为了更直观地看出IAV是如何影响NLRP3炎性小体的激活的，笔者做图以清晰明示(图1)。由于流感病毒对NLRP3的活化发挥着双重作用，因此阐明流感病毒感染对NLRP3活化过程的影响十分关键。下面将阐述流感病毒自身的ssRNA或蛋白以及病毒感染时激活的信号通路对NLRP3炎性小体活化的影响。

图1 甲型流感病毒调控NLRP3炎性小体的机制

3 甲型流感病毒自身因素对NLRP3炎性小体的影响

3.1 甲型流感病毒ssRNA和M2蛋白对NLRP3炎性小体的激活作用

甲型流感病毒自身存在的一些因素，可以刺激NLRP3炎性小体的激活，从而促进IL-1β和IL-18的成熟和分泌。报道显示，使用甲型流感病毒PR8的ssRNA处理小鼠和小鼠骨髓来源树突状细胞(bone marrow-derived dendritic cells，BMDCs)，皆可引起caspase-1依赖性的IL-1β分泌[20]。在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激提供第一危险信号的条件下，利用慢病毒包装的方式，在BMDC中表达离子通道蛋白M2，观察到IL-1β以及IL-18的分泌增加，证明甲型流感病毒M2蛋白可以通过激活第二危险信号来激活NLRP3炎性小体[21]，进一步通过引入M2突变体或使用金刚烷胺(amantadine)[22]处理来阻断M2蛋白，能有效抑制IL-1β的成熟和分泌。以上说明甲型流感病毒中的ssRNA和M2蛋白是激活NLRP3炎性小体的重要因素。

3.2 甲型流感病毒PB1-F2蛋白对NLRP3炎性小体的调控作用

甲型流感病毒中的PB1-F2蛋白常以单体、低聚物或纤维的形式存在，感染细胞后主要定位在线粒体中，可以诱导宿主细胞线粒体途径的细胞凋亡[24]。PB1-F2纤维形式的形成取决于其C端区域是否能够表达全长，这也是高致病性甲型流感病毒的特征之一[28]。在骨髓来源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages，BMMs)中处理LPS，并表达甲型流感病毒PR8(A/PuertoRico/8/34(H1N1))的PB1-F2 C端序列寡肽，能够引发IL-1β的成熟和分泌，未使用LPS刺激的BMM中则没有出现IL-1β的分泌，进一步对caspase-1、ASC和NLRP3基因敲除的3种不同的BMM做相同处理，均没有诱导IL-1β的分泌[23]，说明在高致病性甲型流感病毒感染过程中，其纤维形式的PB1-F2蛋白，能够提供NLRP3炎性小体第二危险信号。有意思的是，在细胞内表达高致病性H7N9的PB1-F2蛋白，可以通过抑制线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein，MAVS)与NLRP3蛋白之间的相互作用，抑制NLRP3炎性小体的形成[29]。

3.3 甲型流感病毒的NS1蛋白对NLRP3的抑制作用

非结构蛋白NS1不仅能抑制干扰素(interferons，IFNs)的抗病毒作用，还能抑制NLRP3炎性小体的活性和IL-1β的分泌。通过研究NS1蛋白及其突变体在体外表达的方式，揭示了NS1蛋白在正常人支气管上皮细胞(normal human bronchial epithelial cells，NHBEs)和THP-1巨噬细胞中的作用。通过抑制NF-κB的激活导致第一危险信号传导的阻断，使NLRP3、pro-caspase-1、ASC、pro-IL-1β和pro-IL-18的mRNA表达水平降低[25-27]。此外，NS1还能通过与NLRP3蛋白相互作用，以及抑制ASC的泛素化来抑制NLRP3炎性小体的组装[25-26]。这些结果表明，甲型流感病毒的NS1蛋白，通过参与抑制第一和第二危险信号，减少NLRP3炎性小体依赖性促炎细胞因子的分泌。

4 甲型流感病毒介导的信号通路及其分子对NLRP3炎性小体的影响

4.1 mTOR对NLRP3炎性小体的激活作用

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，由mTORC1与mTORC2两种不同的蛋白质复合物组成，在细胞存活、增殖和代谢中起关键作用[30]。mTOR异常激活常发生在促炎性疾病的发病机理中，包括脂多糖诱导的急性肺损伤、败血症、动脉粥样硬化和神经退行性疾病，故mTOR成为这些疾病的重要治疗靶点[31]。病毒中的研究发现，甲型流感病毒pdm09(pH1N1)感染BALB/c小鼠时，能够激活mTOR使下游NF-κB活化导致NLRP3、ASC、pro-caspase-1、pro-IL-1β和pro-IL-18的表达上调，并且mTOR激活会诱发ROS的释放，为NLRP3炎性小体提供第二危险信号，在使用抗流感病毒药物奥司他韦(oseltamivir)和mTOR特异性抑制剂西罗莫司(sirolimus)联合喂食且延迟喂食BALB/c小鼠后，有效抑制了病毒介导的NLRP3炎性小体的第一和第二危险信号，降低了pH1N1的复制，且明显地减轻了肺部炎性细胞的浸润和肺损伤的情况[32]。以上结果确定，mTOR是甲型流感病毒感染介导激活NLRP3炎性小体的一个重要蛋白，对甲型流感病毒感染引起的肺炎具有一定的治疗意义。

4.2 Galectin-3对NLRP3炎性体的激活作用

半乳凝素3(Galectin-3)属于β-半乳糖苷结合动物凝集素家族，由约135个氨基酸的保守碳水化合物结合域构成[33]。研究显示，在H5N1感染的小鼠肺部匀浆中，Galectin-3的mRNA和蛋白水平显著上调，使用H5N1分别感染正常的和Galectin-3敲除的BMM，对比发现：后者在病毒感染之后IL-1β的分泌量大幅减少，ASC的低聚物水平下降；在人胚肾293T细胞(human embryonic kidney 293T cells，HEK293Ts)中过表达Galectin-3，其细胞上清液中IL-1β的分泌量增加，且通过免疫荧光检测观察到ASC斑点增多以及ASC与NLRP3的缔合增强[34]。这些结果说明，在甲型流感病毒感染期间能够上调Galectin-3的表达，从而促进NLRP3炎性小体的组装和IL-1β的分泌，揭示Galectin-3在甲型流感病毒感染引发炎症过程中的作用，为炎症的治疗提供了一些理论基础。

4.3 IRF-1对NLRP3炎性小体的激活作用

干扰素调节因子1(interferon regulatory factor-1，IRF-1)是IRF转录因子家族的第一个成员，为IFN和IFN刺激基因(interferon-stimulated genes，ISGs)的调节因子，在抗病毒过程中起到作用[35]。在感染甲型流感病毒PR8的IRF1-/-骨髓衍生巨噬细胞(bone marrow derived macrophages，BMDMs)中，发现由NLRP3介导的caspase-1的活化水平与野生型(wild type，WT)组别相比有了明显地下降，并且降低IL-1β和IL-18的成熟和分泌，使用甲型流感病毒(X31和WSN毒株)感染IRF1-/-BMDM也得到了相同的结果。此外，在感染甲型流感病毒(X31和WSN毒株)的NLRC4和AIM2缺陷细胞中，caspase-1裂解均正常发生，进一步证明了IRF-1在甲型流感病毒感染过程中，具有促进NLRP3炎性体激活的特定作用[35]。IRF-1是Z-DNA结合蛋白1(Z-DNA binding protein 1，ZBP1)的转录调节因子，在甲型流感病毒感染期间能够上调ZBP1蛋白的表达，且ZBP1/DAI是流感病毒固有的传感器，能够在甲型流感病毒感染期间激活NLRP3炎性小体[36-37]。所以，在甲型流感病毒感染期间是通过激活IRF-1/ZBP1/NLRP3信号通路来引起炎症反应的。

4.4 RIPK2对NLRP3炎性小体的抑制作用

受体相互作用蛋白激酶2(receptor-interacting protein kinase 2，RIPK2)是细菌感染引起炎症反应的关键介质，能够调控NF-κB以及MAPK信号通路，以激活炎症细胞并促进促炎细胞因子和趋化因子的分泌[38]。微管相关蛋白1轻链3-II (microtubule-associated protein 1 light chain 3-II，LC3-II)是自噬相关蛋白，通过检查LC3的表达水平是检测自噬活性的一种手段。研究发现，在甲型流感病毒(PR8或X31)感染的RIPK2-/-BMDM中，其LC3-II蛋白表达量以及自噬体的计数，均远低于WT组别的BMDM，且caspase-1的激活得到了增强，IL-18的分泌量增多，RIPK2下游的Unc-51样自噬激活激酶1(Unc-51 like autophagy activating kinase 1，ULK1)的磷酸化水平降低。使用ULK1-/-BMDM感染PR8，观察到相对于WT组别，细胞中线粒体自噬水平下降且caspase-1的活性有明显的上调[39]。这说明RIPK2在甲型流感病毒感染时对NLRP3炎性小体的激活起到负调控作用。

然而，调控NLRP3炎性小体激活的细胞因子还有许多，比如蛋白激酶R(protein kinase R，PKR)能够通过激活NF-κB以促进NLRP3炎性小体的活化[40]；微小RNA-233(microRNA-233，miR-233)能够通过抑制NLRP3蛋白的表达从而抑制炎性小体产生IL-1β[41]；小二聚体伴侣(small heterodimer partner，SHP)能够与NLRP3结合并竞争性地抑制NLRP3和ASC在线粒体上的相互作用从而抑制NLRP3炎性小体的激活[42]；NLRP3炎症小体可经干细胞因子复合体亚单位F-box和富含亮氨酸的重复蛋白2(F-box and leucine-rich repeat protein 2，FBXL2)，介导的泛素化作用后被蛋白酶体降解[43]等，但是这些细胞因子在甲型流感病毒感染宿主时，对NLRP3炎性小体激活的调控机制尚未清楚。

5 NLRP3炎性小体在甲型流感病毒感染期间的抗病毒能力

NLRP3炎性小体在抗甲型流感病毒免疫应答中扮演关键的角色[20,44-45]。研究发现，感染PR8的NLRP3-/-、caspase-1-/-和ASC-/-小鼠与同样感染PR8的WT小鼠相比，支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中IL-6、肿瘤坏死因子- β(tumor necrosis factor- β，TNF-β)、角质形成细胞衍生细胞因子(keratinocyte-derived cytokines，KC)和巨噬细胞炎症蛋白2(macrophage inflamma-tory protein-2，MIP-2)等的表达量以及病毒清除率降低。在这些小鼠中，还观察到嗜中性粒细胞和单核细胞向肺部浸润减少、小鼠死亡率增加的现象[44]。caspase-1-/-小鼠与WT小鼠相比，在感染后显示出更严重的病毒性肺炎，伴有弥漫性肺泡损伤，广泛性上皮坏死，以及甲型流感病毒抗原在肺泡上皮中的表达增加[45]。NLRP3-/-的小鼠在感染甲型流感病毒后，有明显的上皮坏死和气道阻塞的现象，其中纤维蛋白和坏死的细胞碎片出现胶原蛋白的沉积[20]。这些研究表明，NLRP3炎性小体，会限制甲型流感病毒感染后的病毒复制程度，并减轻病毒性肺炎和组织损伤。

6 NLRP3炎性小体的激活对甲型流感病毒致病力的促进作用

机体在感染甲型流感病毒后能够激活NLRP3炎性小体从而促使IL-1β和IL-18成熟和分泌，IL-1β和IL-18分别与多种细胞类型上表达的细胞表面受体IL-1R和IL-18R相结合，以激活NF-kB，转录出炎症因子从而诱导炎症反应[46]，这是机体对抗病毒的一种先天性免疫反应。NLRP3炎性小体的激活能够募集免疫细胞和促炎细胞因子以对抗病毒入侵，然而持续升高的促炎细胞因子浓度能够造成细胞因子风暴，表现为 IL-1β、IL-18、IL-6、IL-17、TNF-α、IFN-γ、干扰素诱导蛋白10(IFN-γ-inducible protein-10，IP-10)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)等细胞因子的异常高表达[47]，以加剧甲型流感病毒诱发肺部损伤的程度。高浓度IL-1β的分泌可以减少细胞上皮钠离子通道，导致肺水肿，并且与急性呼吸窘迫综合征的发生有关[48]，这是严重的甲型流感病毒感染患者的临床特征。IL-18能够诱导T细胞和自然杀伤细胞(natural killer cells，NKs)产生IFN-γ，以及促炎细胞因子引起炎症反应[49]。因此，肺和血清中高浓度的IL-1β和IL-18，与高致病力的甲型流感病毒感染引起强烈的炎症反应有关。

7 治疗甲型流感病毒引发NLRP3依赖性炎症的研究

MCC950是一种针对NLRP3的特异性抑制剂，能够阻止NLRP3炎性小体依赖性caspase-1活化引起的IL-1β和IL-18的成熟和分泌。Coates等[50]研究发现，使用MCC950处理甲型流感病毒A/WSN/33(H1N1)毒株感染的THP-1巨噬细胞，对其细胞上清液进行了ELISA分析。结果显示，caspase-1和IL-1β活化水平受到了明显的抑制，在感染甲型流感病毒WSN毒株后接受MCC950治疗的小鼠，体重减轻的情况得到改善，存活率高于未接受治疗的小鼠，且小鼠肺部caspase-1和IL-1β的活化有明显的下调，说明MCC950可以抑制甲型流感病毒感染引起的NLRP3依赖性炎症反应。巨噬细胞是甲型流感病毒感染期间NLRP3炎性小体激活因子的主要来源，使用MCC950处理被甲型流感病毒WSN毒株感染的肺泡巨噬细胞(alveolar macrophages，AMs)能够抑制NLRP3炎性小体的激活，在小鼠攻毒试验中发现，MCC950不会影响WSN感染时I型干扰素的产生和病毒的清除率[50]。因此，MCC950可做为标靶药物治疗甲型流感病毒感染引发的炎症反应。

8 结语与展望

甲型流感病毒是一种危害人类与动物健康安全，且具有极高传播速度的危险病毒，病毒感染宿主时会激活NLRP3炎性小体，促使IL-1β和IL-18成熟和分泌，引起炎症反应，这是宿主的先天抗病毒手段。过度激活的NLRP3炎性小体会对肺部造成严重损伤，这也是甲型流感病毒感染导致宿主死亡的主要原因。研究发现，甲型流感病毒的ssRNA、M2蛋白以及纤维形式的PB1-F2蛋白均能够促进NLRP3炎性小体的激活，NS1蛋白和H7N9的PB1-F2蛋白能够抑制NLRP3炎性小体激活。在病毒感染时，能够通过激活mTOR，以及上调Galectin-3、IRF-1和RIPK2的表达来调控炎症反应。近年来发现，NLRP3特异性抑制剂MCC950，对甲型流感病毒感染造成的NLRP3依赖性炎症，在小鼠中具有一定的治疗效果。虽然甲型流感病毒感染调控NLRP3炎性小体的机制研究已经取得了较为理想的突破，但是仍然有一系列的问题需要去探索，如NLRP3炎性小体活化机制的进一步研究，在甲型流感病毒感染时，如何通过把控对NLRP3炎性小体激活的正调控和负调控因素，来治疗因炎性小体过度活化而导致的肺部炎症和病理损伤等。本文通过描述甲型流感病毒感染如何调控NLRP3炎性小体的活化机制，为治疗甲型流感病毒引起的炎症反应提供了具有潜力的策略。