动物源性食品中氨苄青霉素残留检测研究进展

李席席，李芳, ，康怀彬, *

1. 河南科技大学食品与生物工程学院（洛阳 471023）；2. 食品加工与安全国家级实验教学示范中心（洛阳 471023）

氨苄青霉素（AMP），又称氨苄西林，是一种β-内酰胺类抗生素，通过抑制胞壁黏肽合成酶，加速破坏细菌的细胞壁，最终致使细菌膨胀裂解[1]。氨苄青霉素具有耐酸不耐酶、杀菌活性强、低毒性和广谱廉价等优点[2]，经常被用于治疗动物呼吸道、尿道、肠胃系统、奶牛乳房炎等疾病，被广泛应用于养殖产业中[3]，因此造成动物源性食品中氨苄青霉素残留的问题[4]。长期食用含有氨苄青霉素残留的动物源性食品（乳制品、肉类、水产品、蛋类、蜂蜜等）会增强机体内细菌的耐药性，加重对肝肾等功能的损害[5]。因此许多国家和组织都对动物源性食品中氨苄青霉素的添加量进行严格控制。欧盟药典规定动物源性食品中AMP≤4 μ g/kg[6]，美国规定牛奶中AMP≤10 μ g/kg[7]，中华人民共和国农业部在2002年修订颁布的《动物性食品中兽药高残留限量》中规定动物性食品中AMP≤50 μ g/kg，并限制牛奶中AMP≤10 μ g/kg[8]。用于检测氨苄青霉素残留的方法有很多，常用方法主要有微生物法、仪器分析法、免疫分析法和生物传感检测[9]。

1 微生物法（MIT）

微生物检测法主要是依据抗微生物药物对特异性微生物的代谢过程有抑制作用和生理作用[10]，从而对样品中抗生素残留进行定性或定量检测[11]，通过观察培养基上抑菌圈的大小进行评估[12]。微生物法主要包括纸片（PD）法、氯化三苯基四氮唑（TTC）法和杯碟（CP）法等。

1.1 纸片（PD）法

嗜热脂肪芽孢杆菌纸片扩散法通常被用来监测微生物生长是否被抑制，抗生素存在时，纸片周围会出现一圈透明的抑菌圈，根据抑菌圈的大小推算待测样品中抗生素浓度的大小。吴谦等[13]用微生物抑制法对动物源性食品中β-内酰胺类药物残留进行检测。结果显示：重复性和再现性标准差分别在3.094%～11.14%和3.141%～13.30%，重现性和再现性很好，可用于肉、鱼、虾和牛乳等动物源性食品中氨苄青霉素残留的检测。马丽苹等[14]采用滤纸片法对牛乳中青霉素类药物残留进行检测，测得青霉素钠最低检测限为1 ng/mL。

1.2 氯化三苯基四氮唑（TTC）法

TTC法是GB/T 4789.27—2008所规定的其中一种方法，依据抗生素会抑制嗜热链球菌正常生长所构建的一种显色法。若待测样品中不存在抗生素或抗生素的浓度过低时，嗜热链球菌快速生长，TTC被还原变成红色；反之，嗜热链球菌生长被抑制，TTC无法被还原，保持原始颜色，根据TTC的颜色变化达到对抗生素测定的目的[15]。Tajick等[16]用TTC法对牛奶样品中的氨苄青霉素进行检测，测得氨苄青霉素残留的检测限为0.004 μg/mL。黄怡君等[17]用TTC法对牛奶中青霉素残留进行检测，测得最低检出量为3 μg/kg。

1.3 杯碟（CP）法

中国出口肉品中青霉素残留检测的主要方法是CP法（SN 0539—1996）。张可煜等[18]用藤黄八叠球菌为实验菌种，用杯碟法来定量分析残存在猪、牛及鸡肉中的青霉素，测得检测下限为0.025 IU/g。

微生物检测法是最传统的抗生素残留检测方法之一。该方法检测对象比较广，适用于大多数动物源性食品中抗生素残留的检测。在检测过程中不需要使用大型仪器，操作简单、低成本、样品回收率高，具有很好的重复性和再现性等优点。但样品测定时间久、特异性差、灵敏度低、易产生假阳性结果，最终导致误差较大等缺点。此外，该方法只能对青霉素总量进行测定，不能检测抗生素的具体组成和含量[19]。

2 仪器分析法

仪器分析法是依据检测样品中抗生素的特定基团或与某些基团所产生得一些特定反应达到对抗生素含量的测定。用于氨苄青霉素残留检测的方法主要有高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法等。

2.1 高效液相色谱（HPLC）法

HPLC用高压下的液体作为流动相，将色谱柱上洗脱下来的有效成分使用不同检测器进行测定。该方法准确性强、灵敏度高，能够对样品中氨苄青霉素残留进行痕量检测[20]。马燕红等[21]通过HPLC对动物源食品中4种青霉素类药物残留进行检测，结果显示所测得的4种青霉素类药物在0.01～2 μg/mL范围内具有良好线性关系，R2＞0.999，检出限3 μg/kg，定量限10 μg/kg，回收率69.9%～100.3%，RSD 1.58%～9.15%，可进一步用于猪、牛、羊、鸡、鱼等不同样品中青霉素类药物残留的检测。该方法采用直接进样，无需衍生化，样品前处理步骤简单、快速。但样品经液液提取和固相萃取柱净化后，会导致某些稳定性差的青霉素药物回收率不理想，检测结果易受基质影响，此外该方法检测成本较高，不易普及。

2.2 液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）法

液相色谱-质谱联用法同时具有液相色谱较高的分离能力和质谱可靠的定性信息。该方法操作简单、快速、高效，可对样品进行定性定量分析[22]。Silvia[23]用HPLC-MS 对牛奶中氨苄青霉素残留进行测定，测得最低检测限为10 μg/kg。张炯恺[24]用HPLC-MS/MS测定乳制品中10大类90种兽药残留的检测方法。对牛奶样品进行处理后，用C18色谱柱洗脱分离、外标法定量分析。结果显示青霉素类抗生素在1～20 ng/mL范围内呈现良好线性相关性，R2＞0.995，检出限0.3 μ g/kg，定量限1 μ g/kg。加标回收率62.4%～134.8%，RSD 5%～10%。贡松松等[25]用超高效液相色谱-四极杆飞行时间高分辨质谱（UHPLC-QTOF MS）技术对生鲜牛乳中80种抗生素和激素进行快速检测。样品经过处理后，用混合标准品进行定性定量分析，结果显示生鲜牛乳中氨苄青霉在50～100 μg/L有良好线性范围，其检出限50 μg/L，定量限100 μg/L。对样品进行加标回收率测定，加标回收率50.2%～119%，RSD0.3%～19.0%之间。王多娇等[26]用超高效液相色谱-串联四极杆质谱（UPLC-MS/MS）测定牛奶中9种青霉素类抗生素残留量的检测方法。牛奶样品处理后除去蛋白、脂肪，用HLB小柱净化、富集。并用青霉素混合标准溶液进行定量定性分析，结果表明牛奶中氨苄青霉素浓度在0.1～100 μg/L范围内有很好线性关系，其中检出限0.4 μg/kg，定量限1 μg/kg，对样品高、中、低3个浓度进行回收率测定，回收率74.8%～84.9%，RSD 7.04%～10.5%。对比高效液相色谱法，液相色谱-质谱联用法能同时检测多种抗生素，具有较宽检测范围和较低的检测线，灵敏度比较高等优点。但是该方法最大的缺点是仪器价格昂贵，不适合大范围推广使用。

3 免疫分析（IAs）法

IAs依据抗原或半抗原与相应抗体可特异性结合的性质，利用酶或其他有色、发光物质对特定抗体（抗原）标记，使其作为选择性试剂对相应待测抗原（抗体）进行定性或定量分析的一种方法。常用免疫分析方法包括酶联免疫吸附（ELISA）法、放射性免疫技术（RIA）、胶体金免疫层析（CGIA）法、荧光免疫检测（FIA）方法等。

3.1 酶联免疫吸附（ELISA）法

ELISA将被测目标物标记的抗体与某种蛋白标记的抗原结合到某种固相载体的表面，一般选用96孔板作载体，并保留免疫活性，与含有辣根过氧化物酶标记的二抗结合，加入酶反应底物，酶催化底物反应发生颜色改变，可以根据颜色的深浅来进行定性或定量分析[27]。刘伟怡等[28]用动物试验建立青霉素类抗生素广谱性酶联免疫分析方法，用于快速检测牛奶中青霉素类抗生素残留的检测。测得8种青霉素类抗生素最低可检测浓度2.22 μ g/mL，检测限0.14 μ g/mL。对其进行特异性测试，结果比较稳定，几乎无交叉反应现象。对牛奶样品进行检测，加标回收率74.0%～

106.3%，变异系数小于0.21%。李佳仪[29]利用基因工程技术制备了抗氨苄青霉素抗体，并建立间接竞争ELISA检测方法。结果显示氨苄青霉素浓度在0.01～1 000 ng/mL具有良好线性关系，R2=0.988 7，检测线和灵敏度分别为0.83和18.43 ng/mL。板间变异系数精密度测定值在0.96%～26.82%。在特异性验证方面，发现氨苄青霉素与卡那霉素、四环素和氯霉素几乎不发生交叉反应，与阿莫西林交叉反应率为46.63%。对样品进行测定时，发现在10～2 000 ng/mL范围内有较高的回收率。回收率在85.22%～96.89%之间，说明该方法可以用来检测食品样品中氨苄青霉素残留。

ELISA技术多采用单克隆抗体制备，有特异性好、专一性高、快速、简便等优点。但由于氨苄青霉素是小分子化合物，存在抗原合成程序复杂、抗体质量不稳定、方法特异性差等问题，并且该方法在操作过程中需要多次洗板，过程比较繁琐，耗时较长。

3.2 放射性免疫技术（RIA）

RIA是以特异性免疫反应为基础，应用放射性同位素对受体进行标记，以完成对靶标检测的新型检测技术。张佳[30]利用14C标记的青霉素G和β-酰胺类兽药共同竞争微生物细胞上的特异性受体，样品中含有β-酰胺类抗生素，就会减少微生物细胞上14C标记的青霉素G的含量，通过检测14C标记的青霉素G的含量，来判断样品中抗生素残留量。该方法分别对猪肉，牛肉、鸡肉、鱼肉、虾肉，添加不同标准品分别为青霉素G，氨苄青霉素等6种青霉素类抗生素进行验证，所有加标样品测定结果均为阳性，筛选准确率100%。该方法具有灵敏度高、特异性强等优点[31]，但是放射性同位素对人体有一定的伤害，需要专业人员进行操作，且费用较高，不易普及。

3.3 胶体金免疫层析（CGIA）法

CGIA有空间分辨的优势，可达到同时检测多种药物的目的，能实现快速检测（一般5～10 min），可通过视觉定性或仪器定量。袁晓春[32]建立一种快速定性检测乳制品中抗生素残留的多重胶体金免疫层析法。样品在测量前不需要处理，可以直接进行检测，整个过程检测速度快，检测时间在8 min以内。测得牛奶中抗生素残留量，均低于我国农业部规定的MRL值，其中氨苄青霉素最低检测限4 μg/L。胶体金作为一种性质优良、合成简便的纳米材料，成本低廉，操作简单，同时结合免疫层析空间分辨、快速简便等优点。传统的胶体金免疫层析法主要通过视觉定性分析，检测结果易受环境因素和检测者等主观因素影响，易出现假阳性和假阴性的结果。基于胶体金光学读取仪的胶体金免疫层析快速定量检测法通过仪器定量分析，可以弥补传统的胶体金免疫层析方法的缺点，结果更可靠，适合现场快速筛查[33]。

3.4 荧光免疫检测方法（FIA）

FIA主要通过荧光素标记的抗体与抗原相结合，充分洗涤分离后，用荧光检测仪观察抗原抗体复合物的荧光强度，进而对样品中痕量物质进行定量测定。FIA专一性强、高灵敏度等优点，可用于测量含量较低的生物活性化合物，并将其列为兽药残留监控的重点。Benito-Pena等[34]用FIA对β-内酰胺类抗生素残留进行检测。测得氨苄青霉素的回收率在99%～105%之间，其检测限为5 μ g/L。尹致丹[35]采用直接竞争型FIA检测牛奶中氨苄青霉素。其原理：将抗原包被在96孔板上，加入一定量的抗体和氨苄青霉素标准品（待测样品）进行竞争反应，待反应结束后，充分洗涤96孔板。在96孔板上加入过量QDs-二抗偶联物孵育，通过测定荧光强度进行定量分析。该方法对牛奶样品进行加标回收率测定，测得回收率94.0%～106.2%，变异系数2.1%～9.2%，检测限2.5 μg/L。其检测结果与ELISA和HPLC两种方法进行对比，结果几乎一致。但是该方法受基质影响比较大，并且二抗制备比较复杂。

4 生物传感检测

生物传感检测是通过检测目标物对传感器识别元件（生化受体）的影响，并将其转化成电信号，以此实现定量或者半定量的特异性检测。生物受体的主要类型有抗体、酶、全细胞及适配体等。生物传感检测有较高的灵敏度、分析速度比较快、易操作、易微型化、制作成本低等优点[36]。常用于检测氨苄青霉素残留的生物传感检测法主要有电化学生物传感检测、光学生物传感检测和光电生物传感检测。

4.1 电化学生物传感检测

电化学生物传感检测通常将识别元件（抗体、适配体、酶等）修饰在电极表面，通过测定电流、电势或阻抗的变化达到对抗生素测定的目的。Mohammad-Razdari等[37]用还原型氧化石墨烯和金纳米颗粒构建青霉素G超灵敏检测的阻抗式适配体传感器，检测极限低至0.8 fM，采用该方法对牛奶、绵羊奶、山羊奶和水牛奶的加标样品中的青霉素G进行测定，回收率92%～104%。Sahihazar等[38]构建基于多壁碳纳米管的阻抗式生物传感器，可用检测阿莫西林、青霉素G和氨苄青霉素残留。该方法与传统传感器相比，具有较高灵敏度、低成本的优点。朱俊亚等[39]用碳二亚胺交联法制备适配体生物传感器法用于牛奶中氨苄青霉素残留的检测。测得氨苄青霉素检测限为1.0×10-12mol/L。对牛奶样品进行加标回收率，测得加标回收率95.24%～101.30%，RSD＜4.38%（n=5）。Liu等[40]用多层Co-MOF@TPN-COF新型纳米材料构建电化学适配传感器检测氨苄青霉素残留，测得氨苄青霉素超低检测限为2.0 ng/mL，可用于检测人体血清、河水和牛奶中氨苄青霉素残留，具有良好的再现性、稳定性和适用性。Taghdisi等[41]用DNA结构和无标记适体构建检测氨苄青霉素残留的电化学适体传感器。其检测限低至1 pmol/L，用于牛奶样品中氨苄青霉素残留的痕量检测。Wang等[42]利用核酸内切酶对双链DNA特异性的剪切作用，当样品中没有抗生素存在时，适配体可以与修饰在金电极表面的互补链杂交形成双链DNA，随后核酸内切酶将dsDNA剪切成DNA碎片残留在溶液中，电子和电极表面传导不会受非导电介质DNA的影响，获得的电化学信号增强；反之，当样品中存在抗生素时，适配体与抗生素结合，无法与修饰在金电极表面的互补链配对形成dsDNA，因此核酸内切酶无法剪切修饰在金电极表面的ssDNA层，电子和电极表面传导受阻，导致电化学信号减弱。通过电信号强弱的改变，用来检测抗生素残留。该方法测得氨苄青霉素检测限为32 pmol/L，低于欧盟规定的最大残留限量（9.93 nmol/L），可用于检测牛奶和水样品中氨苄青霉素残留检测。

4.2 光学生物传感检测

光学生物传感检测主要由感应元件（抗体、酶、适配体等生物材料）和光信号检测对象组成。Adrian等[43]利用检测波长的光学生物传感器测定牛乳磺酰胺、氟喹诺酮、β-内酰胺和四环素等超过30种抗生素。吕晶等[44]用核酸适配体荧光法检测氨苄青霉素。样品中没有氨苄青霉素时，适配体可以吸附在纳米金表面形成保护层，维护纳米金在盐溶液中的分散状态；样品中存在氨苄青霉素时，适配体与氨苄青霉素稳定结合，无法起到保护作用，纳米金在盐溶液中集聚。分散状态的纳米金可以淬灭罗丹明B的荧光，而集聚后的纳米金对罗丹明B的荧光没有影响。通过反应体系荧光信号的强弱实现氨苄青霉素的定量检测。该方法测得氨苄青霉素检测限为0.494 nmol/L，与国际相关检测标准相比较低。并对样品进行加标回收率测定，加标率92%～108.07%，RSD 1.19%～3.79%。

4.3 光电生物传感检测

光电生物传感器是由光信号检测器、生物感应元件和电化学检测器共同组成的一种新型检测方法。Gao等[45]将氨苄青霉素适体作为识别元件固定在CdS/Eu-MOF修饰电极上，构建对氨苄青霉素特定光电流响应的自供电光电适体传感器。对湖水和牛奶样品中氨苄青霉素残留进行检测，其检测线9.3×10-11mol/L。Ge等[46]用BiFeO3/utg-C3N4的优异光电性能，制备一种开-关光电适体传感器，用于检测氨苄青霉素残留，检出限3.3×10-13mol/L，具有很高选择性和灵敏度。

5 结语

微生物分析法、仪器分析法和免疫分析法均属于传统检测方法，每种检测方法各有优缺点。而生物传感检测是近几年应用比较多的检测方法，其识别元件和信号元件比较广。选用适配体作为识别元件，主要原因是由于适配体可以通过体外筛选、PCR扩增等技术进行批量生产，有高的亲和性、特异性强及批次间差异较小等优点[47-48]，能够弥补传统检测方法中的不足。国内外研究发现将适配体和纳米材料相结合应用在生物传感方面，不仅能提高传感器的灵敏度，还具有检测快速、高效的优点，为开发新型抗生素检测方法提供依据。