低分子肝素在反复种植失败中的应用

朱琴玲,孙贇

体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)是治疗不孕不育的有效手段，有部分患者经历多次胚胎移植仍未能获得妊娠，称为反复种植失败(repeated implantation failure，RIF)[1]。RIF尚无统一的定义，多数研究报道RIF定义为移植优质胚胎≥3次或者累积移植≥10个胚胎仍未妊娠[2]。在IVF-ET中，RIF发生率约为10%～15%。胚胎的发育潜能及非整倍体性、母体全身及子宫局部环境等均可能与胚胎种植失败相关。随着胚胎培养技术的优化及植入前胚胎遗传学检测技术的应用，越来越多的研究将胚胎植入失败的主要原因指向母体全身及子宫局部环境，其中母体血液凝固状态、免疫异常与RIF的发生密切相关[3]。低分子肝素(low molecular weight heparin,LMWH)具有高效的抗凝及免疫调节等作用，近年来在生殖领域的应用越来越广泛，但其对RIF患者治疗的有效性尚存争议。因此，本文拟结合国内外的研究进展及临床应用现状，探讨LMWH在RIF中的应用。

1 低分子肝素概述

LMWH是普通肝素通过酶或者化学方法解聚产生的葡萄糖胺聚糖，相对于普通肝素具有更强的生物活性。LMWH主要是与抗凝血酶III结合，抑制凝血因子Xa活性，从而快速抑制血栓形成，但不影响血小板聚集和纤维蛋白原与血小板结合。皮下注射LMWH，能快速发挥作用，达峰时间为3～5 h，半衰期为3～7 h，能快速代谢。LMWH的主要作用是抗凝，用于静脉血栓栓塞性疾病的预防及治疗。但近年来有研究提示，LMWH除了具有高效的抗凝和抗血栓形成作用，还具有免疫调节、促进子宫内膜蜕膜化、促进滋养细胞侵袭及分化、抑制滋养细胞凋亡、保护血管内皮和促进胎盘形成等作用。因此，LMWH在复发性流产及RIF患者治疗过程中的应用越来越受到关注。

常用的LMWH有那屈肝素钙、达肝素钠和依诺肝素钠等，使用剂量有预防剂量和治疗剂量。如果近期无血管栓塞表现或相关病史，推荐使用预防剂量。2018年LMWH防治自然流产中国专家共识[4]推荐预防剂量：那屈肝素钙注射液 2 850 IU(0.3 mL)皮下注射，1天1次；或达肝素钠注射液5 000 IU(0.5 mL)皮下注射，1天1次；或依诺肝素钠注射液4 000 IU(0.4 mL)皮下注射，1天1次。对有近期血管栓塞表现或相关病史的患者则推荐使用治疗剂量，超剂量使用LMWH会增加出血的风险。治疗剂量：那屈肝素钙注射液0.01 mL/kg(95 IU/kg)皮下注射，q12 h；或达肝素钠注射液100 IU/kg 皮下注射，q12 h；或依诺肝素钠注射液100 IU/kg 皮下注射，q12 h。

LMWH常见的不良反应包括：出血、过敏、转氨酶升高、注射部位皮下淤血、瘀斑、荨麻疹等，但多数症状较轻，不影响治疗。LMWH不影响血小板活性，其出血风险低于阿司匹林，有研究报道LMWH未增加阴道出血及产后出血的风险[5]。LMWH不通过胎盘屏障，不分泌于乳汁，未增加胎儿畸形的发生风险，美国食品与药物管理局将其定为妊娠B类药物，可较为安全的用于备孕、妊娠期及哺乳期女性。

2 低分子肝素在合并血栓前状态反复种植失败患者中的应用

血栓前状态(pre-thrombolic state,PTS)是指血液中的有形成分及无形成分发生某些病理变化，使得血液呈高凝状态，从而易于形成血栓的病理状态。PTS根据病因不同分为遗传性PTS和获得性PTS。

2.1 低分子肝素在合并遗传性血栓前状态反复种植失败患者中的应用

遗传性PTS主要是由凝血因子V leiden(FVL) 突变、凝血酶原基因20210GA突变，蛋白C、蛋白S及抗凝血酶缺乏和亚甲基四氢叶酸还原酶突变导致血液高凝的一种疾病。虽然有研究提示遗传性PTS与反复妊娠丢失的发生存在微弱联系，但2017年欧洲人类生殖与胚胎协会(European Society of Human Reproduction and Embryology,ESHRE)指南不推荐在反复妊娠丢失患者中进行遗传性PTS筛查[6]，且遗传性PTS目前并无有效的干预手段，指南指出目前没有足够的证据证明抗凝对遗传性PTS合并反复妊娠丢失患者有益，不推荐在反复妊娠丢失患者中使用肝素治疗[6]。虽然有小样本研究提示RIF患者遗传性PTS发生率相对增加[7-8]，但Nisio及Tan等[9-10]大样本Meta分析提示蛋白C或S缺陷，抗凝血酶缺陷及FVL突变等与IVF妊娠失败无相关性。这表明遗传性PTS与RIF的发生尚存争议，仍需大样本研究进一步证实两者的相关性。而且由于遗传性PTS发生率低，因此目前尚无研究报道LMWH治疗是否能改善RIF合并遗传性PTS患者的妊娠结局。

2.2 低分子肝素在合并获得性血栓前状态反复种植失败患者中的应用

获得性PTS主要包括抗磷脂综合征(antiphospholipid syndrome,APS)、获得性高同型半胱氨酸及其他能引起血液高凝状态的疾病。APS是最常见的获得性PTS，是一种系统性、非炎症性自身免疫性疾病，以体内产生大量抗磷脂抗体(antiphospholipid antibody,APL)为主要特征。APL是一组针对带负电荷磷脂的自身抗体，主要包括抗心磷脂抗体(anticardiolipin antibody,ACL)、狼疮抗凝物(lupus anticoagulant,LA)及抗β2糖蛋白1抗体(β2-glycoprotien 1 antibody,β2-GP1)等。APS好发于育龄期女性，是一种以APL滴度中-高升高，伴有动静脉血栓形成、妊娠早期流产、中晚期死胎和胎盘功能不全等不良妊娠结局及不孕等临床表现的综合征[11]。复发性流产患者5%～20%可检出APL阳性[12]，2020年自然流产诊治中国专家共识及2017年ESHRE反复妊娠丢失指南均推荐对具有连续或非连续2次或2次以上妊娠丢失患者进行APL筛查[6,13]。APL会增加子宫内膜胚胎植入位点形成微血栓的概率，进而影响子宫内膜蜕膜化和滋养细胞的粘附及侵袭，从而可能导致胚胎植入失败[14]。在不孕女性人群中，典型APS患者较少，临床上多为单纯APL阳性的患者。由于实验室检测方法及诊断阈值不同，不孕症人群APL阳性检出率存在巨大差异，研究报道显示为0～31.9%，显著高于正常已生育人群[15]。但APL阳性是否影响IVF妊娠尚存争议。2008年美国生殖医学协会(ASRM)指出APL阳性并不影响IVF妊娠结局，不推荐在辅助生殖助孕人群中常规进行APL筛查[16]。但后续多项研究提示APL阳性与IVF妊娠失败密切相关，2011年Nisio等[9]纳入超过5 000人的Meta分析研究提示，APL阳性患者IVF妊娠失败风险是非阳性患者的3倍，建议在IVF妊娠失败人群中进行APL筛查。但值得注意的是，目前研究不孕人群APL阳性率及其对IVF妊娠结局的影响，多是小样本的回顾性研究，仍需大样本、前瞻性临床研究明确其与IVF妊娠结局的相关性。

APS导致不良妊娠结局或不孕最主要的机制是母胎界面的血栓形成，因此其核心治疗是抗凝和抗血小板治疗。2018年低分子肝素防治自然流产中国专家共识及2017年ESHRE反复妊娠丢失指南推荐合并APS的复发性流产患者使用低剂量阿司匹林及LMWH进行抗凝治疗[4,6]。2018年低分子肝素防治自然流产中国专家共识推荐对于单纯APL阳性而非典型APS患者，既往无自然流产史或仅有1次孕10周内的自然流产者，单独使用低剂量阿司匹林(50～75 mg/d)治疗，不建议使用LMWH[4]。2019年欧洲抗风湿病联盟(The European League Against Rheumatism，EULAR)指南建议单纯APL阳性女性，在妊娠时使用小剂量阿司匹林(75～100 mg/d)以预防血栓形成[17]。对于合并APS的RIF患者使用LMWH进行抗凝治疗只有少量病例报道，证据级别较低[18-19]。对于合并单纯APL阳性的RIF患者，多数学者建议使用阿司匹林和/或LMWH抗凝治疗以提高妊娠率和改善不良妊娠结局[20-22]，但也有研究报道阿司匹林联合LMWH并不改善RIF妊娠结局[23]。因此，合并APL阳性的RIF患者，亟需前瞻性、大样本临床研究以明确抗凝治疗的必要性及确切的治疗方案。

3 低分子肝素在合并自身免疫性疾病反复种植失败患者中的应用

自身免疫性疾病是以免疫系统对机体自身抗原耐受降低，大量产生自身抗体和免疫复合物，最终导致多种组织器官功能受损为特征的一类疾病。自身免疫性疾病谱分布广泛，包括70多种疾病，如系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)、类风湿性关节炎、系统性硬化、干燥综合征(sjogren syndrome,SS)、混合结缔组织病等。自身免疫性疾病患者常可检测到自身免疫性抗体，这些免疫复合物可广泛沉积于血管内皮，导致内皮损伤，血小板凝聚，可诱发动静脉血栓，从而会增加流产、死产等不良妊娠的发生[24]。因此自身免疫性疾病的活动期，常不建议妊娠。SLE及类风湿关节炎等自身免疫性疾病患者常因疾病活动及治疗延迟生育，从而会增加不孕发生的风险。2017年EULAR指南推荐SLE病情稳定的患者，当合并不孕因素时，可采用IVF助孕，但需警惕促排卵过程中超生理水平雌激素导致的血液高凝[11]。自身免疫性疾病采用IVF治疗时需处于疾病稳定期，但其持续存在的自身免疫抗体是否会影响IVF妊娠结局尚存争议。2019年Nørgård等[25]报道类风湿关节炎患者活产率显著低于正常患者，类风湿关节炎伴随的免疫异常可能会影响胚胎植入。目前尚未有研究报道RIF患者合并自身免疫性疾病的发生概况，自身免疫性疾病与RIF发生的相关性尚需进一步研究。

抗凝治疗能够在一定程度改善复发性流产合并自身免疫性疾病患者的妊娠结局。2018年低分子肝素防治自然流产中国专家共识推荐所有复发性流产合并SLE患者在备孕当月使用低剂量阿司匹林或联合LMWH治疗，并在孕期持续使用[4]。对合并原发性干燥综合征的复发性流产患者不建议常规使用LMWH治疗，但需定期监测凝血功能，严密观察胎儿、胎盘受累的临床表现，给予针对性及选择性的抗凝治疗。对合并继发于SLE或APS的SS患者，则按照SLE及APS患者的LMWH治疗策略。而合并未分化结缔组织病的复发性流产患者，妊娠期应密切关注凝血指标变化，一旦出现易栓倾向，应及时给予LMWH进行干预，同时根据凝血指标进行调整。但是，目前没有指南或高质量的临床研究报道合并自身免疫性疾病RIF患者的抗凝治疗策略，临床干预强调IVF助孕前对原发自身免疫性疾病的积极治疗与控制，在IVF促排卵过程中采用温和刺激避免过高的雌激素水平，抗凝治疗大多参考合并自身免疫性疾病复发性流产患者的治疗策略。

4 低分子肝素在合并子宫血流灌注异常反复种植失败患者中的应用

子宫动脉是供应子宫血液循环的重要组成部分，正常的子宫血流灌注是胚胎植入及胚胎发育所必需的。超声是测量子宫动脉及子宫内膜血流动力学参数最常用的手段，常用的评估指标包括搏动指数(pulsatility index,PI)、阻力指数(resistance index,RI)、收缩期峰值流速及舒张期流速比值(S/D)，PI、RI及S/D值越低，子宫动脉及子宫内膜螺旋动脉阻力越小。有学者认为子宫动脉血流参数，尤其是PI是预测子宫内膜容受性及胚胎植入的重要参数[26-27]。但也有学者认为子宫动脉血流参数并未影响妊娠，PI不具有预测妊娠的指示意义[28-29]。子宫内膜血流对子宫内膜容受性的预测价值仍有待提升，其灵敏度为100%，但特异度仅为8%[30]。同时有研究提示子宫动脉及内膜血流参数对RIF患者妊娠结局的影响尚存争议。2017年Li等[31]研究报道RIF患者子宫动脉RI显著高于妊娠患者，并指出子宫动脉RI高与子宫内膜微血管密度减少相关，从而可能导致植入失败。2020年Tong等[32]回顾性队列研究发现RIF患者妊娠组与非妊娠组子宫内膜及内膜下PI、RI及S/D并未有显著差异。虽然超声是检测子宫内膜参数最常用的手段，但目前研究提示子宫动脉血流、内膜血流等预测妊娠的价值都存在一定局限性，不同超声机器及不同人员测量存在一定误差，缺乏高质量的研究明确子宫动脉及子宫内膜血流阻力增加的诊断界值，因此尚需大样本研究明确这些血流动力学参数在预测妊娠及RIF中的作用。

虽然目前尚不明确子宫动脉及子宫内膜血流阻力与妊娠的相关性，但仍有小样本回顾性研究报道LMWH具有降低不明原因复发性流产患者子宫动脉阻力指数，改善子宫动脉及胎盘血流灌注，从而提高不明原因流产患者的活产率[33-34]。而在RIF患者中，国内学者谭小方等[35]报道LMWH可显著降低子宫动脉血流指数，但未报道其是否可改善妊娠结局。国外也尚未见相关研究报道，表明LMWH可通过改善RIF患者子宫动脉或子宫内膜血流提高临床妊娠率或活产率。因此，亟需大样本高质量的临床研究明确LMWH干预在合并子宫血流灌注异常RIF患者中的有效性。

5 低分子肝素在不明原因反复种植失败患者中的应用

LMWH除了具有高效的抗凝作用，还可能通过调节免疫耐受、促进子宫内膜蜕膜化、促进滋养细胞增殖、侵袭及分化等途径促进胚胎植入。因此，LMWH在不明原因复发性流产及RIF患者中的应用越来越受到关注。2015年法国和德国开展的2项大型多中心RCT研究提示LMWH并不能提高不明原因复发性流产患者的活产率[36-37]，2017年ESHRE反复妊娠丢失指南不推荐在不明原因反复妊娠丢失患者中使用LMWH[6]。对不明原因RIF患者采用LMWH治疗的有效性也存在争议。2009年Urman等[38]纳入150例患者的RCT研究中发现LMWH具有改善不明原因RIF患者临床妊娠率和活产率的趋势，在RIF中的应用具有一定临床价值。2011年Berker等[39]纳入207例患者的RCT研究中发现LMWH并不能改善不明原因RIF患者的妊娠结局。2013年Potdar等[14]纳入3项RCT研究的Meta分析结果显示低等强度证据提示LMWH可以增加RIF患者活产率，但纳入研究样本量较小，且1项研究中的RIF患者合并PTS。2015年Hamdi等[40]纳入100例患者的RCT中研究发现LMWH并不能提高RIF患者妊娠率。2017年Siriststidis等[41]纳入115例患者的回顾性队列研究发现强的松联合LMWH亦不能改善不明原因RIF患者妊娠率及活产率。2018年Yang等[42]纳入5项RCT研究的Meta分析发现在未合并PTS患者中LMWH并不能有效提高RIF患者的临床妊娠率。因此，LMWH在不明原因RIF患者中治疗的有效性尚不明确，亟需大样本、前瞻性临床研究明确其疗效。

综上所述，RIF病因复杂，临床治疗手段有限。虽然基础研究提示LMWH除了具有高效的抗凝和抗血栓形成作用，还具有免疫调节、促进子宫内膜蜕膜化、促进滋养细胞增殖、侵袭及分化等作用，但目前缺少高质量的临床研究明确LMWH对RIF患者治疗的有效性，现有的临床研究结果亦存在许多争议。目前对于合并单纯APL阳性的RIF患者，使用阿司匹林和/或LMWH抗凝治疗可以提高妊娠率，改善不良妊娠结局，但均为小样本研究，循证医学证据级别低。对于合并自身免疫性疾病的RIF患者，目前缺少发生概况及抗凝治疗策略的研究报道，临床实践中更强调IVF助孕前对原发病的积极治疗与控制。虽然有研究认为LMWH可降低子宫动脉血流指数，但子宫动脉血流指数与妊娠结局的关系尚存争议，更缺乏有效的循证医学证据明确LMWH改善RIF患者子宫动脉或子宫内膜血流后的临床获益。现有的研究亦不支持LMWH在不明原因RIF患者治疗中的有效性。因此，在临床工作中，我们应客观、理性看待LMWH在RIF治疗中的作用，根据病因进行针对性治疗，切忌把LMWH当成常规的保胎药物。今后，亟需大样本、多中心的前瞻性临床研究来明确LMWH在RIF患者中的应用价值。