大孔树脂纯化岩高兰多酚的工艺研究

高 媛 邢文馨 王慧梅*

（1. 东北林业大学，森林植物生态学教育部重点实验室，化学化工与资源利用学院，哈尔滨 150040；2. 东北林业大学生命科学学院，哈尔滨 150040）

岩高兰（Empetrum nigrum）是岩高兰科（Empe⁃traceae）岩高兰属（Empetrum）植物，岩高兰科共有3 属10 种，而在中国，岩高兰科仅有岩高兰1 个变种，是国家二级保护植物［1～2］。在我国主要分布在东北部大兴安岭的高海拔地区，在吉林省长白山高海拔地区也有很少的分布［3］。作为一种珍贵的药用植物，岩高兰具有独特的生物学特性和药用价值。

岩高兰中含有丰富的黄酮类、黄酮醇类、黄烷三醇类、酚酸类等多酚类化合物［4～5］。近年来，多酚类化合物因其强大的生物活性功能，如抗氧化、抗辐射、防治心脑血管疾病、预防癌症等，越来越受到人们的关注［6～7］。植物多酚还具有解酒护肝、抗炎镇痛、保护牙齿等作用［8］。因此，岩高兰具有很好的开发利用前景。

研究表明，岩高兰的地上部分具有良好的抗血管生成、抗氧化、抗炎、抗菌等生物活性［5，9～10］。大孔吸附树脂法作为一种高效、绿色分离提取技术，具有选择性高、干扰因素少、可重复循环利用等特点，从而被广泛用于化工、医药、食品、农业等领域［11～12］。目前还未有通过大孔树脂富集纯化岩高兰地上部分多酚的报道，因此本研究将利用大孔树脂法提取岩高兰地上部分的多酚，为岩高兰多酚的提取纯化工艺提供新的技术路线和基础数据。

1 实验方法

1.1 岩高兰多酚样品的制备

将岩高兰的地上部分（茎和叶）洗净烘干，用粉碎机粉碎样品并过60目筛。精确称取10 g岩高兰样品粉末，加入400 mL 醋酸盐缓冲溶液（50 mmol·L-1，pH=5）。精确吸取387 U·g-1单宁酶、224 U·g-1纤维素酶加入到样品溶液中，在38℃下以125 r·min-1培养3.4 h。培养结束后，在锥形瓶中加入无水乙醇，使此时瓶内的乙醇浓度为60%。将其置于42℃、300 W 的超声波清洗仪中超声22 min后，在9 600×g 离心10 min，将上清液旋转蒸发，除去溶剂，备用。

1.2 多酚含量的测定

采用Folin-ciocalten 法测定岩高兰中多酚的含量［13］，并以没食子酸为对照。精确吸取1.0 mL 样品于试管中，并加入2.5 mL，浓度为0.2 mol·L-1的Folin-ciocalten 试剂。将试管充分振荡后静置3～4 min，加入0.8 mL，浓度为10%的Na2CO3溶液，定容到10 mL。摇匀后置于25℃恒温水浴中反应2 h。同时做试剂空白，于765 nm 下测定吸光度。以没食子酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，确定其回归方程为Y=0.348X+0.005，R2=0.999 3。

1.3 大孔吸附树脂的筛选

1.3.1 树脂预处理

将不同型号的大孔树脂在95%乙醇中浸泡24 h，使其充分肿胀；采用湿法装柱，用蒸馏水冲洗至无醇味；用5% HCl 溶液浸泡4 h，用蒸馏水冲至流出液为中性；用5%NaOH溶液浸泡4 h，用蒸馏水冲至流出液为中性；将冲洗后的树脂在蒸馏水中浸泡24 h，收集备用［14］。具体树脂类型及其参数见表1［15］。

表1 6种类型大孔吸附树脂物理参数Table 1 Physical parameters of six types of macropo‐rous resins

1.3.2 树脂含水率的测定

将预处理好的大孔树脂分别精密称取1.0 g，在90℃下烘干至恒重，称取质量。计算不同型号树脂的平均含水率。每组实验做三次重复实验。

1.3.3 静态吸附试验

分别称取经过预处理的6 种大孔树脂各1.0 g，置于100 mL 具塞锥形瓶中，再加入25 mL 0.4 mg·mL-1的岩高兰多酚粗提液。在30℃，100 r·min-1的恒温摇床中充分振荡吸附8 h。取1 mL上清液，按照Folin-Ciocalteu 法测定A 值、计算其多酚浓度，并计算各树脂的吸附率。

式中：C0、C1为吸附前、后吸附液中多酚浓度。

1.3.4 静态解吸附试验

将静态吸附后的树脂过滤，用5 BV 蒸馏水冲洗除杂，并吸干表面水分。再置于具塞锥形瓶中，加入25 mL 60%乙醇，在30℃，100 r·min-1恒温摇床中充分解吸附8 h，取1 mL 上清液，测定A 值并根据下式计算解吸率。

式中：C2为解吸液多酚浓度。

1.4 动态曲线的测定

1.4.1 动态吸附曲线的测定

取0.4 mg·mL-1粗 提 物 上 样 液100 mL，以1 mL·min-1的流速上样至装有最佳大孔吸附树脂5 g的层析柱（15 mm×200 mm）中，每流出10 mL 收集一份流出液。测定各流出液多酚的质量浓度。以上样液体积为横坐标，流出液质量浓度为纵坐标，绘制动态吸附曲线。

1.4.2 动态解吸曲线的测定

采用5 BV 蒸馏水除去树脂间的杂质，用60%乙醇以1 mL·min－1的流速进行解吸附，每流出5 mL 收集一份解吸液，共收集10 份。测定解吸液中岩高兰多酚的质量浓度。以解吸液体积为横坐标，流出液质量浓度为纵坐标，绘制动态解吸曲线。

1.5 响应面法优化提取纯化工艺设计

根据单因素试验结果（数据未列出），选取对岩高兰多酚提取效果影响较大的上样浓度、乙醇浓度、洗脱流速、洗脱体积为考察因素，以提取率为响应值，利用Design Expert.V8.0.6软件进行响应面优化试验设计，确定岩高兰多酚的最佳提取工艺。试验因素水平及编码见表2。

表2 试验因素水平及编码Table 2 Test factor levels and codes

1.6 验证试验与放大试验

1.6.1 验证试验

根据响应面实验结果分析得到大孔树脂纯化岩高兰多酚的最佳工艺。在该条件下进行3 次重复验证试验，测得在最佳工艺条件下岩高兰多酚的实际值。并计算与理论值的相对误差百分数、纯化前后多酚的纯度及回收率，具体公式如下：

式中：V1为上样液体积；V2为解吸液体积；M0为洗脱液干燥后样品的质量。

1.6.2 放大试验

前期试验使用的层析柱均为15 mm×200 mm小型柱，故在实际操作过程中，管壁效应等一些不确定因素会对试验结果产生一定的影响［16］。为确定试验结果的可靠性，采用40 mm×400mm 中型柱进行30倍放大试验。

2 结果与讨论

2.1 大孔吸附树脂的筛选结果

通过对6种类型的大孔树脂进行含水率、吸附率和解吸率3种性能的考察，可以发现AB-8、D101和HPD-600 型大孔树脂的含水率和吸附率较高，分别达到73%以上和62%以上；HPD-100、X-5、和HPD-600 的解吸率较高，可以达到53%以上。结合表中数据综合分析，HPD-600 型大孔树脂的含水率为76.74%、吸附率为72.49%、解吸率为77.25%，均为最高，且差异均有统计学意义（P<0.001），故可确定HPD-600 型大孔树脂为纯化岩高兰多酚的最佳树脂（具体结果见表3）。

表3 6种类型大孔树脂的含水率、吸附率、解吸率Table 3 Moisture content，adsorption rate and desorp‐tion rate of six types of macroporous resin

2.2 动态曲线的绘制

由图1A可知，当上样液体积为10 mL时，岩高兰多酚开始少量泄露，随着上样液体积的增大，流出液中多酚的浓度呈上升趋势。当上样液体积达到40 mL 后，可能由于大孔树脂的吸附达到饱和，故随着上样体积的增加，流出液岩高兰多酚的质量浓度趋于平缓［17］，故确定上样体积为40 mL。

由图1B 可知，60%乙醇对岩高兰多酚的洗脱效果良好。当洗脱体积为10 mL 时，可以获得较纯的岩高兰多酚解吸液，当洗脱液体积大于10 mL后，多酚质量浓度开始下降。故确定10 mL 为解吸液最适体积。

2.3 响应面试验结果

2.3.1 岩高兰多酚浓度回归模型的建立及显著性检验

HPD-600 型大孔树脂提取纯化岩高兰多酚的响应面试验设计及结果见表4。

通过Design Expert.V8.0.6 软件进行回归拟合分析［18］，建立提取条件和提取率之间的二次多项式模型为：

Y=209.83+37.15A-0.55B10.16C+58.48D+1.20 AB+9.73AC+9.75AD+12.37BC-3.52BD-16.78CD-37.78A2-32.77B2-19.35C2-44.42D2

二次回归模型的方差分析结果见表5。由表可知，本模型具有统计学意义（P<0.000 1），各因素影响程度依次为洗脱体积（D）>上样浓度（A）>洗脱流速（C）>乙醇浓度（B）。其具备良好的准确性和通用性（R2=0.9359，R2adj=0.871 9），因此可以用此模型进行大孔树脂纯化岩高兰多酚的分析与检测。

表4 响应面试验设计及结果Table 4 The experiment design and results of Box-Behnken

2.3.2 响应面优化的交互作用

响应面分析各因素之间的交互作用对岩高兰多酚提取率的影响见图2。图2A 为上样浓度和乙醇浓度对提取率的影响。当乙醇浓度一定时，上样浓度由0.60%增加至0.87%，多酚提取率增加趋势显著，当上样浓度大于0.87%后，提取率略微降低。如图2B 所示，提取率随着上样浓度和洗脱流速的提高有先上升后下降的趋势。上样浓度对提取率影响的显著性要明显大于洗脱流速对其的影响，当上样浓度保持不变时，随着洗脱流速的增大，提取率增加的趋势较为平缓，达到最大值后，呈缓慢下降的趋势。由图2C 可知，随着上样浓度和洗脱体积的增大，提取率急剧增大，其3D 图呈一个开口朝下的陡峭的曲面。当上样浓度一定时，洗脱体积由1.0 BV 增至2.8 BV 的过程中，提取率一直急剧增加，当洗脱体积大于2.8 BV 后，提取率才出现了缓慢降低的趋势。从图2D 可以看出，随着乙醇浓度和洗脱流速的改变，提取率变化不明显。由此可见，乙醇浓度和洗脱流速对提取率影响的程度较小。图2E 为乙醇浓度和洗脱体积对提取率的影响。乙醇浓度较低时，洗脱体积与提取率呈正相关，洗脱体积越大，提取率越大；但当洗脱体积大于2.7 BV 时，提取率略有降低。从图2F 中可以看出，当洗脱体积保持不变时，洗脱流速在0.50～0.91 mL·min-1的范围内，提取率略有上升；当洗脱流速大于0.91 mL·min-1后，提取率逐渐降低。

表5 二次回归模型的方差分析Table 5 Analysis of variance of quadratic regression model

综上所述，分析可知最优纯化工艺条件为：上样浓度0.84 mg·min-1；乙醇浓度62.15%；洗脱流速0.67 mL·min-1；洗脱体积2.71 BV。在此条件下，岩高兰多酚提取率为229.18 mg·g-1。

2.4 验证试验与放大试验

2.4.1 验证试验

考虑实际操作的便利性与局限性，将最佳提取工艺条件修正为［19］：上样浓度0.85 mg·mL-1；乙醇浓度62%；洗脱流速0.65 mL·min-1；洗脱体积2.70 BV。在该条件下进行3 次重复验证试验，测得岩高兰提取率为230.61 mg·g-1与理论值（229.18 mg·g-1）相对误差为0.62%，说明该提取方法具有准确性和可靠性，可应用为大孔树脂提取纯化岩高兰多酚的工艺路线。在最佳工艺的基础上，计算得出纯化后多酚纯度由8.11% 提高到22.56%，回收率为67.78%。

2.4.2 放大试验

通过将HPD-600 型大孔树脂进行放大30 倍试验，结果发现经大孔树脂纯化后岩高兰多酚提取率为253.38 mg·g-1，而纯化前多酚提取率为56.47 mg·g-1，我们可以看出经树脂纯化后的多酚产量明显提高，纯化后多酚浓度为纯化前多酚浓度的4.49 倍。因此HPD-600 型大孔树脂可用于岩高兰多酚的提取纯化。

3 结论

本实验采用大孔吸附树脂提取纯化岩高兰中的多酚，通过对6种树脂含水率、吸附率、解吸率性能的筛选，选择HPD-600 型树脂作为最佳的树脂。并通过动态吸附、解吸试验确定上样体积和解吸体积分别为40 和10 mL。采用响应面法对纯化条件进行优化，得到最佳工艺条件下的多酚提取率为229.18 mg·g-1。经大孔树脂纯化后多酚纯度由8.11%提高到22.56%，回收率为67.78%。因此，大孔树脂对岩高兰多酚具有较好的纯化效果，且工艺选择性强、环保性高、成本低廉，可为岩高兰的深入研究提供参考。