鹿脑小分子活性肽对D-半乳糖所致衰老模型小鼠的保护作用※

●陈克成 魏 宇 丁云录 陈浩诚 李庆杰※※ 刘 爽

（1.吉林金梓源生物科技有限公司 吉林 四平 136000；2.吉林农业大学中药材学院 吉林 长春 130118；3.长春中医药大学附属医院 吉林 长春 130021；4.澳大利亚三叶草健康研究院 澳大利亚 悉尼 NSW 2000）

衰老伴随着记忆力下降、免疫力低下、细胞凋亡、氧化物水平升高以及脑、胸腺、脾脏、肝、肾等组织器官的退化及病变。衰老是不可避免的，但减慢衰老的速度是可行的，因此找到具有确切效果且作用机制明确的抗衰老药物是非常重要的。梅花鹿作为重要的药用动物资源已经被广泛研发和应用，药用及保健价值巨大，但鹿脑除了古人应用并记载其具有补骨髓、补虚劳、益脑等作用外，尚未在现代医药行业中见到对其研究和应用，为更好地利用鹿脑，本文对鹿脑小分子活性多肽进行了初步研究。

鹿脑小分子活性多肽是以梅花鹿鹿脑为原料，经酶解、提取、分离、纯化获得的分子量范围在1~6KDa 之间的小分子活性多肽。本研究采用D-半乳糖所致衰老小鼠模型，观察鹿脑小分子活性肽对衰老小鼠的学习记忆行为、重要脏器的形态和病理变化、脑组织BDNF、NGF 含量和脑组织BDNF 蛋白表达的影响，为进一步开发鹿脑小分子活性肽的抗衰老药用价值、延缓脑衰老提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物选择SPF 级ICR 小鼠，雌雄各半，体重均在18~22g 之间。动物合格证号：SCXK-（吉）2018-0007，购于长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。饲养环境，室温21～23℃，相对湿度40%～60%，室内12h 明暗自动切换，通风良好。动物购买回来后，分别放入笼中饲养，自由进食、喝水。

1.1.2 药品及试剂鹿脑小分子活性肽，性状：浅黄色粉末，批号：20191201，由长春中医药大学附属医院中医药研究中心提供。吡拉西坦片，规格：400mg/片，批号：190821，浙江爱诺生物药业股份有限公司产品。D-半乳糖（D-gal），规格：100g/瓶，批号：1AN10203，上海源叶生物科技有限公司产品。神经营养因子（BDNF）试剂盒，规格：96T/盒，批号：E20190901A；神经生长因子（NGF）试剂盒，规格：96T/盒，批号：E20190901A，均购自美国RD 公司。组织固定液，规格：5 000mL/瓶，批号：18121204，广州维格斯生物科技有限公司产品。

1.1.3 仪器及器材酶标仪，型号：BIO680，Japan BIO RAD 公司产品；Morris 水迷宫视频跟踪分析系统，型号：DB001，北京智鼠多宝科技有限公司产品；图像分析系统，型号：NIS-ELEMNT BR，日本NIKON 公司产品；光学显微镜，型号：OlympusBX51，日本Olympus 公司产品；台式高速低温离心机，型号：Allegra X-64R，美国贝克曼公司产品；电热恒温水浴锅，型号：BHS-6，上海凌科实业有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 实验分组选用SPF 级ICR 小鼠，雌雄各半，共60 只。将用普通饲料进行喂养7d 后的小鼠，随机分配给正常对照组、模型对照组、阳性对照药吡拉西坦（300mg/（kg·d））剂量组、鹿脑肽小分子活性组高剂量组（100mg/（kg·d））、中剂量组（50mg/（kg·d））和低剂量组（25mg/（kg·d））共6 组，10 只/组[1-2]。

1.2.2 造模及给药建立小鼠衰老动物模型，分为模型对照组、阳性对照组和鹿脑小分子活性肽3 个剂量组，分别皮下注射D-半乳糖150mg/kg，正常对照组皮下注射等体积生理盐水，每日注射给药1 次，连续6 周。实验期间自由摄食饮水，节律光照。在造模的同时灌注供试药品混悬液，正常对照组及模型对照组灌注蒸馏水。每天进行1 次灌胃，持续6 周。每隔一天称量一次各组小鼠体重，并调节给药剂量[3]。

1.2.3 Morris 水迷宫实验给药结束后第2 天进行Morris 水迷宫实验，检测小鼠的空间学习记忆能力。实验时水的深度为20cm，温度（25±1）℃，将小鼠从第二象限标记处逐个放置在水池中，并使小鼠面对墙壁，自动录像系统记录了小鼠从下水到爬上平台的时间（以四肢爬上平台为准），这就是逃避潜伏期。如果小鼠在2min 内不能到达平台，就要将小鼠引导至平台，时间记为2min。当小鼠爬上平台休息10s 后，进行其他小鼠的测试，每只小鼠每天1 次，共4d。第5 天，撤除平台，面向池壁将小鼠放入水池中，以小鼠首次通过平台的时间和2min 内通过原平台的次数来评价小鼠的学习记忆能力[4]。

1.2.4 取材及检测行为学实验结束，1%戊巴比妥0.5～1.0mL 腹腔麻醉，解剖取脑，称量全脑重量，按公式计算脑指数；剪取一部分脑组织，用组织固定液固定，石蜡包埋，切片，HE 染色，做病理组织学检查；采用免疫组化SABC 法观察切片BDNF 的水平。另称切取脑组织100mg，冷生理盐水冲洗，加入冷生理盐水进行匀浆，将得到的匀浆液在0～4℃温度下以3 500r/min 的转速进行离心，15min 后将所得上清液按说明书方法操作，通过ELISA 试剂盒对BDNF、NGF 含量进行测定[5]。解剖胸腺和脾脏，去除表面脂肪膜，用冷盐水冲洗组织表面上的残留血液，用滤纸吸干，称重后计算内脏指数。计算公式：

脏器指数=脏器质量（mg）/体质量（g）

1.3 统计学处理

2 结果与分析

2.1 鹿脑小分子活性肽对D-半乳糖所致衰老模型小鼠学习记忆能力的影响

结果显示，与正常对照组比较，模型组小鼠明显增加了逃避潜伏期、减少了穿台次数（P<0.01）。鹿脑小分子活性肽剂量为100mg/kg、50mg/kg 和25mg/kg 剂量组时，与模型组相比，逃避潜伏期缩短，穿台次数显著增加（P<0.01 或P<0.05）。结果见表1。

表1 鹿脑小分子活性肽对D-半乳糖所致衰老模型小鼠逃避潜伏期及穿台次数的影响

2.2 鹿脑小分子活性肽对D-半乳糖所致衰老模型小鼠脑、胸腺和脾脏指数的影响

与正常对照组比较，模型组小鼠脑、胸腺和脾脏指数均显著下降（P<0.01），这表明D-半乳糖所致衰老小鼠的脑和其他免疫器官等在逐渐发生萎缩。鹿脑小分子活性肽100mg/kg、50mg/kg 和25mg/kg 三个剂量组小鼠胸腺指数均有不同程度增加，与模型对照组比较，有显著性差异（P<0.01 或P<0.05）；鹿脑小分子活性肽100mg/kg、50mg/kg 两个剂量组中小鼠脑指数、脾脏指数均有一定程度的增长，与模型对照组比较，表现出显著性差异（P<0.01 或P<0.05）。说明鹿脑小分子活性肽能表现出不同程度的抗脑萎缩和抑制衰老模型小鼠胸腺和脾脏的退化作用，增强小鼠免疫功能。结果见表2。

表2 鹿脑小分子活性肽对D-半乳糖所致衰老模型小鼠脑、胸腺和脾脏指数的影响

2.3 鹿脑小分子活性肽对D-半乳糖所致衰老模型小鼠脑组织中BDNF、NGF 含量的影响

在本实验中，与正常对照组比较，模型组中小鼠脑组织中BDNF、NGF 含量显著减少（P<0.01）。鹿脑小分子活性肽100mg/kg、50mg/kg两个剂量组小鼠脑组织中BDNF、NGF 含量显著增加，与模型组大鼠比较差异显著（分别为P<0.01 或P<0.05）；鹿脑小分子活性肽25mg/kg剂量组小鼠脑组织中BDNF 含量，与模型组大鼠比较，具有显著性差异（P<0.05）。结果见表3。

2.4 鹿脑小分子活性肽对D-半乳糖所致衰老模型小鼠脑组织中BDNF 蛋白表达的影响

本实验中，模型对照组与正常对照组比较，小鼠脑组织中BDNF 蛋白表达明显降低，具有显著性差异（为P＜0.01）。鹿脑小分子活性肽100mg/kg、50mg/kg 和25mg/kg 三个剂量组与模型对照组比较，小鼠脑组织中BDNF 蛋白表达明显升高，具有统计学意义（P＜0.01 或P＜0.05）。结果见表3。

表3 鹿脑小分子活性肽对D-半乳糖所致衰老模型小鼠脑组织中BDNF、NGF 含量及BDNF 蛋白表达的影响

2.5 衰老小鼠脑组织HE 染色组织病理学变化

图1-6 结果显示，正常对照组，小鼠脑组织的细胞膜连续、完整，海马区神经元细胞结构、形态、大小正常，细胞排列紧密有序，胞质充盈，能清晰地看到细胞核、核仁和胞浆。模型对照组，小鼠脑组织出现部分深染的现象，细胞变小，细胞核呈固缩、破碎状；海马神经元细胞数量较少，排列紊乱、疏松， 形态不规则， 胞核模糊、固缩和胞浆减少，细胞不再充盈、结构变得模糊不清，表明有部分脑细胞发生坏死。与模型组比较，吡拉西坦组、鹿脑小分子活性肽高、中、低剂量组均可明显改善上述病理改变，细胞坏死较轻，细胞结构、形态完整，且细胞的边缘清晰，染色质较为均匀，其中鹿脑小分子活性肽高剂量组减轻脑细胞坏死的作用最为显著，中、低剂量组作用与高剂量组比较略弱。

3 讨论

衰老是整个人体形态结构和生理功能全面下降的复杂动态过程，与中枢神经系统退行性疾病的发生密切相关，防治衰老所致的神经系统退行性疾病、延缓脑衰已成为当今衰老生物学领域的重点研究课题[6-11]。以鹿脑小分子活性肽为研究对象，通过制备衰老小鼠模型，探讨了鹿脑小分子活性肽抗衰老作用、对神经系统保护作用及其作用机制。

D-半乳糖诱导的衰老模型是国内外比较公认的动物衰老模型，成模动物显示的各种老化现象与自然衰老相似，现已被广泛用于抗衰老药物的筛选和衰老的机理研究中[12-18]。而学习过程中所体现出来的记忆能力是评价脑衰老重要指标中的一个[19-21]。在这项研究中，采用水迷宫实验，测定小鼠学习和记忆能力，发现与正常对照组相比，模型对照组小鼠逃避潜伏期明显延长，穿越原始平台位置次数明显减少，提示模型组小鼠已有脑衰老的行为学表现。与模型对照组相比，鹿脑小分子活性肽各给药组小鼠逃避潜伏期明显缩短，穿越原始平台位置次数明显增加。实验结果表明，鹿脑小分子活性肽能够干预衰老进程，可以显著拮抗D-半乳糖对小鼠学习记忆功能的损伤。

脏器及腺体指数的变化可以初步衡量机体衰老程度。脾脏为体内最大的外周免疫器官，主要功能是为各种成熟的淋巴细胞提供免疫应答场所；胸腺是免疫调节的中心器官，对免疫应答和细胞免疫功能的发生有重要作用；胸腺、脾脏和脑重量均会随着机体的老龄化进程而变轻，是反映动物在衰老变化过程中的主要指标，因此，脑、胸腺和脾脏指数的降低可间接反应机体的衰老程度。本次实验研究可以得出，鹿脑小分子活性肽具有延缓小鼠脏器退化、提高免疫力及促进新陈代谢的作用，能有效增强衰老小鼠的体质，减缓小鼠脑萎缩及脏器功能的下降。

脑源性神经营养因子（Brain derived neurotrophic factor， BDNF）是在大脑中合成的蛋白质，它在中枢神经系统中的分布也十分广泛，在中枢神经系统不断地发育进程中，能够对神经元的存活状态、分化情况、生长发育中都具有至关重要的作用。研究发现，在神经系统疾病的发病过程和治疗中也有BDNF 的参与，cAMP/PKA/CREB/BDNF 信号转导通路与许多神经系统疾病引起的认知功能障碍有关[22-27]。本实验结果提示，鹿脑小分子活性肽可以逆转D-半乳糖所引起的cAMP/PKA/CREB 抑制作用，在细胞水平可以明显提高D-半乳糖所致的BDNF 分泌降低作用，这也提示了鹿脑小分子活性肽在衰老动物模型中抗衰老作用可能是通过提高cAMP/PKA/CREB/通路的活性，促进脑内神经元BDNF 的表达和分泌，防止受损神经元的死亡，改变神经元的一系列病理状态，促进受损神经元的再生和分化，并在成熟的中枢和周围神经系统中维持神经元的存活和正常的生理功能。

本研究发现，经鹿脑小分子活性肽干预后，衰老小鼠在水迷宫实验中空间认知功能得到改善，学习记忆功能得到提高；可以减缓小鼠脑萎缩及胸腺、脾脏功能的下降，可以明显提高D-半乳糖所致脑组织中降低的NFG、BDNF 水平；能抑制脑组织病变，减少脑细胞凋亡，从而维持细胞和组织的正常功能，达到保持机体健康和延缓衰老的作用。本实验结果也提示，鹿脑小分子活性肽可能具有改善脑血流，营养脑神经细胞，使受损神经细胞（或休眠的神经细胞）得到修复或激活作用，它可能对促进缺血区域侧支循环的建立起积极作用。