小鼠椎间盘退变模型的CBX8改变△

周 旭，丁 悦，王明飞，刘铖祎，蔡 叶

（上海中医药大学附属普陀医院，上海 200062）

腰椎间盘突出症是脊柱外科临床中非常常见的一类退变性疾病，是引起腰腿痛的常见原因；症状严重者可导致下肢功能障碍，甚至瘫痪；给社会造成巨大的经济负担［1-2］。好发年龄在20～50岁、病因主要为与年龄有关的退行性变［3-4］。染色质结合蛋白（chro⁃mobox protein homolog 8,CBX8）属于 polycomb group（PcG）蛋白家族，其家族成员参与了调控细胞增殖分化；控制基因表达的稳定［5-7］，甚至失衡导致恶性肿瘤的发生［8-9］。现有报道脊柱退行性疾病的发生与细胞DNA的损伤有一定的关联［10］，而CBX8作为PcG蛋白家族成员参与了DNA损伤修复。然而CBX8在小鼠椎间盘髓核细胞的体内表达以及功能还未知，因此本研究制备CBX8小鼠的针刺椎间盘退行性疾病模型，分别于针刺后8、12、16周进行检测，观察小鼠脊柱的稳定性、椎间隙高度、髓核细胞的衰老以及炎症介质的表达情况，评估椎间盘退变程度以及CBX8与小鼠椎间盘退变的相关性。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料仪器

SPF级C57BL/6小鼠，18～20 g，雄性31只。主要实验试剂：Tris-SDS分离胶缓冲液（pH8.8），Tris-SDS浓缩胶缓冲液（pH6.8），PMSF，ECL-化学发光液，15-150KDa双色预染maker，BSA，RIPA裂解液（强）等。主要仪器：恒温摇床，化学发光仪，磁力搅拌器，匀浆器，低温高速冷冻离心机，电转仪，垂直电泳仪，酶标仪等。

1.2 体外实验

1.2.1 体外髓核细胞分离与培养

取3只小鼠，雌雄不限。以0.5%戊巴比妥钠0.1mg/kg体重腹腔注射，麻醉后采用心脏采血方法处死，后立即浸泡于75%乙醇30 min，消毒皮肤后放置超净台中解剖。铺无菌手术巾，取后正中切口，取出整个腰椎，尖刀切开纤维环,将髓核完整取出并剪碎至约1 mm3，随即放入0.25%的胰蛋白酶液中37℃下消化25 min。消化后使用离心机低速离心8 min（1 200 r/min），吸取上清液后反复洗涤3次，再将组织放入Ⅱ型胶原酶（含15%胎牛血清）中搅拌消化3 h。离心去除上清液；加入含15%胎牛血清的培养液后，清洗离心，去除上清液，重复3次；最后吹打细胞并且镜下记数，按5×104/ml的密度种植髓核细胞于培养瓶中，并且放入培养箱中培养，培养基选择DMEM F-12（含15%的胎牛血清）。细胞融合为单层时用胰蛋白酶消化后进行细胞传代培养。

1.2.2 体外髓核细胞鉴定

采用免疫组织化学检测鉴定:细胞爬片PBS冲洗2 min，4%多聚甲醛固定30 min，加3%H2O2室温孵育10 min灭活内源性过氧化物酶。PBS洗3次，滴加羊抗鼠Ⅱ型胶原多克隆抗体（1∶200），4度冰箱孵育过夜，PBS洗3次，滴加生物素标记二抗驴抗羊IgG多克隆抗体 （1∶500），37℃孵育 30 min，PBS洗3次，DAB显色10 min，PBS冲洗，苏木素复染1 min，中性树脂封片后光镜下观察，鉴定原代培养的细胞为髓核细胞。

1.3 体内实验

1.3.1 动物分组与处理

将小鼠随机分成三组，具体分组如下：正常对照组8只，假手术组8只，模型组12只。正常对照未给予手术处理；假手术组仅行手术显露，未损伤椎间盘；模型组小鼠采用穿刺法构建椎间盘退变模型，方法如下：

小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠，剂量为50 mg/kg；麻醉成功后，无菌铺单，常规碘酒酒精消毒术区3遍，纵行依次切开小鼠尾部皮肤、皮下、分离肌肉及结缔组织，暴露腰椎椎间盘；使用31G穿刺针刺入椎间盘1 mm，时间约60 s（针斜面刚好完全进入椎体）造成椎间盘退变。

1.3.2 动物观察

小鼠苏醒后半小时放回笼内继续饲养，术后1～3 d密切观察小鼠全身状况、伤口愈合及四肢活动能力；之后每周观察两次小鼠精神状况、活动能力、体重、毛发等。

定时称体重。于建模8、12、16周三个时间点，每个时间点每组处死3只小鼠，解剖脊柱，测量小鼠椎体高度以及椎间盘高度，重复3次后取平均值，计算椎间盘高度指数（disc height index,DHI）。观察小鼠脊柱的稳定性、椎间隙高度等情况，评估椎体及椎间盘退变程度。

1.3.3 Westblot检测

对动物模型，相应时间点处死动物，取椎间盘组织。BCA法制备组织裂解液，采用SDS-PAGE凝胶电泳免疫印迹（转膜）及免疫显色，分别检测蛋白多糖、II型胶原和CBX8的含量。

1.4 统计学方法

采用SPSS 26.0软件进行统计学分析。计数资料采用x2检验；计量资料以±s表示，组间比较采用独立样本t检验，组内比较采用单因素方差检验；P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体外实验

2.1.1 免疫组织化学鉴定

通过Ⅱ型胶原免疫组化染色来鉴定小鼠的原代髓核细胞见图1。可见胞浆里有黄褐色颗粒沉着，并且核周区较多，使用苏木素复染后髓核区为蓝色，证实为髓核细胞。

图1 髓核细胞Ⅱ型胶原免疫组化染色（×200）。可见胞浆里有黄褐色颗粒沉着，并且核周区较多，使用苏木素复染后髓核区为蓝色，证实为髓核细胞

2.1.2 RT-PCR检测结果

RT-PCR检测髓核细胞中蛋白多糖，II型胶原和CBX8的mRNA相对表达量结果见表1。与原代髓核细胞相比，第5代髓核的II型胶原蛋白mRNA几乎不表达（P<0.05），蛋白多糖的mRNA表达也显著下降（P<0.05），但是CBX8的mRNA表达水平却显著增加（P<0.05）。

表1 RT-PCR检测原代与第5代髓核细胞mRNA相对表达结果 （±s） 与比较

表1 RT-PCR检测原代与第5代髓核细胞mRNA相对表达结果 （±s） 与比较

蛋白多糖CBX8images/BZ_63_945_2404_1180_2470.pngimages/BZ_63_204_2537_379_2603.pngimages/BZ_63_379_2537_630_2603.png1.00±0.00 1.00±0.00images/BZ_63_630_2537_945_2603.png0.23±0.02 1.68±0.26images/BZ_63_945_2537_1180_2603.png<0.001 0.010

2.2 体内实验

造模手术后三组小鼠活动能力、体重、毛发等无明显差异。三组小鼠体重测量结果见图2，显示三组动物小鼠体重随时间变化而改变，相应时间点，三组动物体重的差异均无统计学意义（P>0.05）。

图2 三组小鼠不同时间点体重的变化。三组动物小鼠体重随时间变化而改变，相应时间点，三组动物体重的差异均无统计学意义（P>0.05）

大体标本观察见图3，正常对照组及假手术组及正常对照组的椎体高度无明显变化，椎体无侧位退变的发生。模型组的椎体发生一定程度的退变性侧弯，椎体的高度也明显下降。

图3 三组小鼠脊柱标本大体观察左：正常对照组；中：模型组；右：假手术组。正常对照组及假手术组及正常对照组的椎体高度无明显变化，椎体无侧位退变的发生。模型组的椎体发生一定程度的退变性侧弯，椎体的高度也明显下降

三组II型胶原和CBX8相对含量的westblot检测结果见表2。随时间推移，三组动物的II胶原蛋白含量均呈下降趋势（P<0.05），其中模型组的下降最为明显。相应时间点，模型组的II型胶原蛋白含量均明显低于正常组及假手术组（P<0.05）。随时间推移，正常组CBX8的含量持续下降（P<0.05），而假手术组术后12周CBX8达峰值，尔后下降，不同时间点差异有统计学意义（P<0.05）。相应时间点，模型组CBX8的含量均显著高于正常对照组和假手术组，差异有统计学意义（P<0.05）。

表2 West blot检测三组动物II型胶原蛋白和CBX8蛋白相对表达结果（±s）与比较

表2 West blot检测三组动物II型胶原蛋白和CBX8蛋白相对表达结果（±s）与比较

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3 讨论

椎间盘由外围的纤维环和中心的髓核组成；髓核又是由软骨细胞和蛋白多糖黏液样基质构成的弹性胶冻物质；髓核合成分解的平衡失调导致了椎间盘的退变发生及平衡失调。因此活化髓核细胞，改善细胞外环境，有可能延缓甚至逆转椎间盘组织退变进程的发生及发展［11-14］。所以髓核细胞生物学活性的维持甚至加强，现在已经成为研究脊柱退行性疾病的重点和热点。

Ⅱ型胶原蛋白和蛋白多糖是正常髓核的重要表型特征，丝状的胶原蛋白纤维、弹性蛋白以及蛋白多糖融合后形成的网状立体结构，能够产生一定的生物学强度；其在活体髓核细胞中具有营养供给、维持渗透压和髓核细胞形态的作用，椎间盘退变过程中，Ⅱ型胶原蛋白含量降低，也能够间接反映髓核细胞的增殖和活力情况［15］。本实验中髓核细胞通过多次培养传代，在第3代后即出现生长缓慢，功能逐渐丧失的表象，同时检测传代后的细胞中细胞成分变化，发现II型胶原及蛋白多糖的表达逐渐减少，CBX8表达增加，说明CBX8参与了髓核细胞的退变进程。Maertens等［16］也发现CBX8的表达能够在一定程度上有着延缓成纤维细胞衰老的作用。

本实验中模型组的细胞II型胶原含量明显低于假手术组和正常组，CBX8的含量却明显增加，说明CBX8与髓核细胞的退变密切相关且有着一定的维持髓核细胞增殖能力。Dietrich等［17］发现CBX8具有促进成纤维细胞的生长的能力，并且是通过INK4AARF通路来进行。

腰椎间盘突出症是脊柱外科临床中非常常见的一种退变性疾病。椎间盘的退变其实从青中年就已经开始，引发甚至加速退变的主要因素就是髓核的变性。所有脊柱疾病的发生主要由内外两个因素导致，内在因素主要是脊柱整体的退变，导致椎体失稳，外在因素主要是外伤、劳损、环境变化等因素。目前引起椎间盘退变的明确分子机制尚没有明确的结论，但研究发现退变的发生与椎间盘中的各种细胞生物分子因素相关。

临床上治疗椎间盘退变最理想的方法是在分子层面早期的人为干预，保持其生物学特性及功能。生物基因治疗是目前腰椎退行性变系列疾病治疗的新的方法，这种方法主要是针对髓核细胞退变的内在活性及分子成分，通过基因分子层面中调控基因的表达来纠正退变椎间盘细胞中功能方面的缺陷，从而延缓或阻止，甚至逆转椎间盘退变进程。本实验发现PcG蛋白家族中的CBX8在小鼠退变模型中表达随着退变的发展逐渐增加，提示CBX8可能在髓核细胞的衰老退变进程中发挥重要的作用，这也许就为将来的基因治疗提供了一个新的靶点。本研究的不足之处为：造模的小鼠和人类的自然退变模式不符，另分子通路相关的研究未得到进一步证实；相信随着科学的进步，相似性更高的动物模型会进一步阐明椎间盘退变的分子机制。