河南省部分地区硬蜱种类鉴定及无形体携带情况调查

张 艳，彭永帅

(1.河南牧业经济学院 动物医药学院，河南 郑州 450046；2.郑州市兽医生物制品技术重点实验室，河南 郑州 450046)

蜱是吸食血液为生的节肢动物，可吸食多种脊椎动物包括人类的血液，其作为传播媒介的能力仅次于蚊子[1]。蜱可传播多种病原，包括细菌、病毒和原虫等，其中一些病原具有人兽共患特点，给畜牧业造成重大损失，并影响人类健康。目前在中国境内已发现的蜱共有10个属，117个种，其中包含13个软蜱种，超过100个硬蜱种[2]。

无形体属于立克次氏体目(Rickettsiales)，无形体科(Anaplasmataceae)，无形体属(Anaplasma)，该属的成员包括嗜吞噬细胞无形体(A.phagocytophilum)、绵羊无形体(A.ovis)、牛无形体(A.bovis)、边缘无形体(A.marginale)、扁平无形体(A.platys)、中央无形体(A.centrale)和新发现的山羊无形体(A.capra)。其中嗜吞噬细胞无形体和山羊无形体具有人兽共患特点，其它无形体种则具有不同的宿主倾向，主要感染动物的血细胞，引起无形体病。该病的主要临床症状为发热、贫血、黄疸、流产、衰弱、消瘦等，急性发病时可使动物死亡。蜱是无形体病的主要传播媒介。我们采集了河南省部分地区寄生于山羊、绵羊等动物体表的蜱，首先对其进行种类鉴定，然后使用巢式PCR方法扩增蜱体内的嗜吞噬细胞无形体、绵羊无形体、牛无形体和边缘无形体，并对得到的基因序列进行种系发育分析，以期为该地区无形体病的防控提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源

2011年7月～2012年9月分别自河南洛阳、三门峡、商丘、南阳、平顶山、郑州、安阳、驻马店等14个地市30个采样点共采集蜱虫样品355只，混池法提取DNA共计100份。2016年5月8日自许昌市襄城县某肉牛场采集蜱虫56只，其中32只镜检观察，其余24只混池法提取DNA 5份。合计DNA样本共105份。所采集的硬蜱均来自动物体表，其中绵羊体表73份，山羊体表12份，牛体表11份，犬体表3份，刺猬体表6份。

1.2 主要试剂

动物组织基因组DNA提取试剂盒，源自康为世纪公司；rTaq DNA 聚合酶、LA Taq DNA聚合酶，源自Takara公司；75%乙醇、10% KOH溶液、琼脂糖凝胶电泳相关试剂等。

1.3 硬蜱样品的镜检

前处理：将4 ℃保存的硬蜱置于10% KOH溶液中，在酒精灯火焰上加热，根据虫体大小确定加热消化时间，至虫体透明为止。

镜检：将消化透明后的虫体置于洁净载玻片上，滴加甘油水，盖上盖玻片，于显微镜下观察，重点观察部位为假头基、眼、口器、缘垛、气门板、尾突等。

1.4 PCR

硬蜱组织DNA的提取参照试剂盒说明书进行。硬蜱种类鉴定所用的靶基因为硬蜱的16S rDNA基因和内部转录间隔区2(internal transcribed spacer，ITS-2)基因。检测硬蜱携带的无形体病原所用的靶基因与具体引物序列见表1。

PCR反应体系为：10×Buffer 2.5 μL，dNTPs 2.0 μL，上下游引物各0.5 μL，DNA模板1.0 μL，rTaqDNA聚合酶0.2 μL，ddH2O补足至25 μL。扩增硬蜱ITS-2基因及巢式PCR的第一轮反应中，使用LA Taq DNA聚合酶代替rTaq DNA聚合酶，PCR缓冲液也使用该酶对应的缓冲液，其余相同。

巢式PCR反应，第一轮反应条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min 30 s，35个循环，72 ℃延伸5 min；第二轮反应条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环，72 ℃延伸5 min。扩增硬蜱16S rDNA的反应条件同上述第二轮反应条件，扩增硬蜱ITS-2基因的反应条件同上述第一轮反应条件。

1.5 PCR产物检测及序列分析

使用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR所得产物，将阳性产物送交测序公司进行双向测序，其中硬蜱ITS-2基因的每个样品均进行3次测序反应，以便拼接后获得完整的基因序列。

使用NCBI的BLAST工具在线比对，找出与目标序列高度同源的序列，同时从GenBank数据库下载不同地区、不同宿主来源的相应基因序列，用Mega X 10.0.5软件，在Kimura 2-parameter模型下进行种系发育分析，并采用最大似然法(ML法)构建系统发育进化树，Bootstrap进行1000次重复检验。

表1 本实验所用引物

2 结果

2.1 硬蜱种类鉴定结果

对2016年采集自某肉牛场肉牛体表的32只硬蜱进行消化透明后，显微镜下观察其形态特征，结果见图1。由图可知，该蜱肛侧板长，副肛侧板稍短，气门板呈长圆形，无缘垛，假头基呈六边形，齿式4/4，每纵列8枚齿，尾突呈三角形。综合上述形态特征可初步判定其可能为微小牛蜱(B.microplus)。

A、B：雄性微小牛蜱整体图；C：微小牛蜱假头基部位；D：雄性微小牛蜱腹部及尾突。标尺=50 μm。图1 微小牛蜱形态

以硬蜱组织基因组DNA为模板，扩增其16S rDNA基因和ITS-2基因部分序列，扩增得到了与预期大小一致的目的条带(图2)，将阳性产物全部送交公司测序，对105份硬蜱样品的测序结果进行BLAST比对，发现本文扩增得到的基因序列与微小牛蜱(16份)、长角血蜱(83份)、褐黄血蜱(6份)的相应基因序列同源性>98%，不同蜱种的宿主来源见表2。根据16S rDNA和ITS-2基因构建的系统发育进化树也显示本文所得序列与上述三种硬蜱的对应序列遗传差异非常小。

由上述形态学和分子生物学种类鉴定结果推测，本研究采集的硬蜱样品分属于微小牛蜱(16份)、长角血蜱(83份)、褐黄血蜱(6份)三个蜱种。

M：DNA标准DL 2000；1～10：硬蜱样品16S rDNA 基因(A)和ITS-2基因(B)扩增结果。图2 硬蜱16S rDNA和ITS-2基因PCR结果

表2 不同硬蜱种类的宿主来源

2.2 硬蜱体内无形体感染情况

对105份硬蜱基因组DNA样本，使用表1中引物对扩增4种无形体(嗜吞噬细胞无形体、牛无形体、绵羊无形体和边缘无形体)的部分基因序列，PCR扩增结果如图3～图5所示，上述引物均扩增得到了与预期大小一致的目的条带。

M：DNA标准DL 2000；1～8：蜱组织DNA样品；9：阳性对照；10：阴性对照。图3 硬蜱样品嗜吞噬细胞无形体16S rRNA扩增结果

M：DNA标准DL 2000；1～9：蜱组织DNA样品；10：阳性对照；11：阴性对照。图4 硬蜱样品绵羊无形体和边缘无形体msp4扩增结果

M：DNA标准DL 2000；1～19：蜱组织DNA样品；20：阴性对照；21：阳性对照图5 硬蜱样品牛无形体16S rRNA扩增结

105份硬蜱样品感染无形体的整体情况见表3。由表可知，83份长角血蜱均有无形体感染，其中绵羊无形体的阳性率最高，为26.5%；1份长角血蜱样本检测到了人兽共患病原——嗜吞噬细胞无形体；另外还有1份长角血蜱样本中检测到绵羊无形体和牛无形体的混合感染。微小牛蜱样本中只检测到边缘无形体，未发现其他种类的无形体。褐黄血蜱样本中上述4种无形体均为阴性。总体而言，本调查所采集的蜱虫样品中，绵羊无形体的感染率最高，为20.9%(22/105)，其次为边缘无形体(5.7%，6/105)，1份长角血蜱样本检测到嗜吞噬细胞无形体这一人兽共患病原。

表3 三种硬蜱的无形体感染情况

2.3 4种无形体的种系发育分析

将上述PCR扩增得到的阳性样品全部送交测序公司进行测序，再对测序结果进行比对，找出有差异序列，最终共得到嗜吞噬细胞无形体序列1条(19-1)；牛无形体序列2种(b2和b02-1)，二者仅有1个碱基的差异；绵羊无形体序列2种(11和22)，二者相差2个碱基；边缘无形体序列2种(p54和p66)，二者只有1个碱基存在差异。将上述得到的序列结合GenBank下载的其他序列，构建系统发育进化树，如图6和图7所示，嗜吞噬细胞无形体和牛无形体基于16S rRNA基因构建进化树，绵羊无形体和边缘无形体基于msp4基因构建进化树。由图可知，本研究得到的序列均与已知的相应该无形体种的序列位于同一进化分支上。

使用Mega X 10.0.5软件中Kimura two-parameter模型，构建的最大似然法进化树。○代表本研究得到的嗜吞噬细胞无形体序列；□代表本研究得到的牛无形体序列。图6 基于16S rRNA基因的嗜吞噬细胞无形体(A. phagocytophilum)和牛无形体(A. bovis)进化树

使用Mega X 10.0.5软件中Kimura two-parameter模型，构建的最大似然法进化树。●代表本研究得到的边缘无形体序列；■代表本研究得到的绵羊无形体序列。图7 基于msp4基因的绵羊无形体(A. ovis)和边缘无形体(A. marginale)进化树

3 讨论

本调查采集自动物体表的蜱虫样本中，长角血蜱占比最高，为79.0%(83/105)，其次为微小牛蜱(15.2%，16/105)，还有6份采集自刺猬和犬体表的褐黄血蜱(5.7%)。105份蜱虫样品中，83份长角血蜱均有无形体感染，其中绵羊无形体占比26.5%，仅有1份(0.9%)样品为嗜吞噬细胞无形体阳性，该病原为人兽共患病原；微小牛蜱样本中只检测到边缘无形体；褐黄血蜱样本中上述4种无形体均为阴性。整体上，本调查所采集的蜱虫样品中，绵羊无形体的感染率最高，为20.9%(22/105)，其次为边缘无形体(5.7%，6/105)，1份长角血蜱样本种检测到嗜吞噬细胞无形体这一人兽共患病原。

长角血蜱一般在气候温暖地区分布较多，如美国的多个州、加拿大、日本、韩国及中国的大部分地区[9-13]。2012年，陈卓等[14]自河南信阳10个村庄的家畜体表采集蜱虫308只，鉴定后发现96.75%为长角血蜱，其余为微小牛蜱。这一结果与本调查所得结果整体一致。

2000年，曹务春等在黑龙江的森林牧场采集到372只全沟硬蜱，并在该批硬蜱体内检测到粒细胞埃立克体[15]，这是全世界首次在全沟硬蜱体内检测到病原。之后我国学者在多个省份不同种类的硬蜱体内检测到多种血液中寄生的病原，包括立克次氏体、梨形虫、螺旋体等[16]。有研究表明，美国加利福尼亚地区的太平洋硬蜱体内嗜吞噬细胞无形体的感染率为0.8%[17]，这一结果与本调查得到的嗜吞噬细胞无形体阳性率非常接近。曹务春等[18]在黑龙江和内蒙地区采集的全沟硬蜱中检测到的嗜吞噬细胞无形体阳性率高达4.6%(62/1 345)，分析发现其采样地区为高山森林区，植被异常茂盛，为硬蜱的繁殖及病原传播提供了良好条件。Anifowose OI等的研究发现，采集自牛体表的彩饰璃眼蜱体内的反刍兽埃利希体感染率显著高于牛血液中该病原的感染率[19]。在中国东北的哈尔滨市一项关于蜱虫种类及其携带病原的调查中，作者发现长角血蜱是动物体表的优势蜱种，而采集自植被上的蜱虫中，全沟硬蜱则是优势蜱种。该研究鉴定出的5种蜱中，检测到2种人兽共患的立克次氏体：雷氏立克次氏体(Rickettsiaraoultii)和新塔拉塞维奇立克次体(CandidatusRickettsiatarasevichiae)，且来自动物体表的蜱虫的病原感染率显著高于采自植被的蜱(40.7% vs 19.5%)[20]。由此推测动物在人兽共患蜱传疾病的传播过程中发挥着重要作用。