微波水解—氨基酸自动分析仪法测定饲料中色氨酸的含量

宋 洁，王丽芳，姚一萍，史 培，钟华晨，郭晨阳，张欣昕，黄 洁

［1.农业农村部农产品质量安全风险评估实验室（呼和浩特） 内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031；2.内蒙古自治区动物营养与饲料科学重点实验室 内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古 呼和浩特 010018］

色氨酸（tryptophan） 是一种功能性必需氨基酸，分为D-型、L-型和DL-型3 种同分异构体，天然存在且易被动物代谢吸收的为L-型［1］。 L-色氨酸是除酪氨酸和蛋氨酸之外的三大氨基酸饲料添加剂之一，不仅能参与蛋白质的生物合成，而且是5-羟色胺、褪黑素、色胺、烟酸等典型生理活性物质的生化前体，具有促进动物生长发育、提高免疫力、改善肉品质等作用［2-4］。 由于动物自身不能合成色氨酸，必须从饲料中摄取，饲料中色氨酸含量的准确测定， 对于动物体内色氨酸平衡及正常新陈代谢至关重要［5-6］。

目前，色氨酸的测定主要通过常规碱水解，结合高效液相色谱或分光光度法。 然而常规碱水解耗时过长，色氨酸会被轻微破坏，烘箱温度也不易控制［7］。 此外，液相色谱法存在出峰较慢、分析时间长、检测灵敏度低等问题。分光光度法易受颜色深浅或杂质干扰，影响测定结果准确性［8］。 近年来，微波技术因其反应快、能耗低、易操作等优势日益受到关注。采用微波碱水解法水解样品，不但可以避免常规碱水解的缺点， 而且易于控制碱水解条件，结合全自动氨基酸分析仪上机测定，两者均具有安全、省时、操作简便等优点。 氨基酸含量测定主要受水解时间、 水解温度及水解液浓度等因素影响［9］，因此，该研究利用微波消解仪筛选出微波碱水解的最佳碱浓度、水解温度和水解时间，并联合氨基酸自动分析仪快速测定饲料中色氨酸含量， 建立的方法适用于大规模饲料样品中色氨酸的高效、准确测定，对于饲料营养品质评定工作具有参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

L-色氨酸标准品（L-Trp，纯度≥99%），美国Sigma 公司；甲醇（色谱纯），北京迪马科技公司；氢氧化钠（分析纯），天津市风船化学试剂科技有限公司；盐酸（优级纯），成都市科隆化学品有限公司。饲料样品为奶牛全混合日粮（TMR），购自内蒙古当地饲料市场。

1.2 仪器与设备

Mars240/50 微波消解仪 （美国CEM 公司）；S433D 氨基酸自动分析仪 （德国Sykam 公司）；XS105 万分之一天平 （瑞士Mettlr Toledo 公司）；ED115 干燥箱（德国Binder 公司）；Milli-QA10 超纯水仪（美国Millipore 公司）；TGL-20M 台式高速冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）。

1.3 标准溶液的配制

L-色氨酸标准储备液： 精确称取色氨酸标准品20.4 mg，加适量水和数滴0.1 mol/L 的氢氧化钠溶解，用水定容至100 mL，浓度为1.0 μmol/mL，4 ℃冷藏保存，有效期1 个月。

L-色氨酸标准工作液：准确吸取1.0 mL 色氨酸标准储备溶液置于10.0 mL 容量瓶， 用水稀释至刻度，浓度为0.1 μmol/mL，即为色氨酸标准上机液，4 ℃冷藏保存，有效期2 周。

1.4 试验方法

1.4.1 单因素试验在微波消解功率1 200 W、升温10 min、NaOH 为碱解剂条件下，选取水解温度140、150、160、170、180 ℃，水解时间10、20、30、40 min，碱浓度3、4、5、6 mol/L 分别进行单因素试验，研究这3 个因素对色氨酸含量测定结果的影响。

1.4.2 正交试验根据单因素试验结果， 以水解温度、水解时间、碱浓度为研究对象，采用L9（34）正交表，设计三因素三水平正交试验，开展9 次试验，每次试验设置3 个重复（见表1）。

表1 微波水解条件筛选正交试验因素水平表

1.4.3 样品处理对于脂肪含量小于4%的样品，准确称取0.050 0～0.100 0 mg （精确至0.000 1 g），置于聚四氟乙烯消解管中， 加5 mL 氢氧化钠溶液，充氮气1 min，根据单因素和正交试验条件选择碱浓度、水解温度和水解时间进行微波水解。取出消解管，冷却至室温，转移至25 mL 容量瓶，用6 mol/L 盐酸中和，调pH 值至中性，并用水定容，10 000 r/min 离心10 min， 用0.45 μm 滤器过滤后上机测定。对于脂肪含量大于4%的样品，需要先经过脱脂处理再按上述步骤进行色氨酸含量测定。

1.4.4 统计分析试验结果采用SPSS 20.0 软件GLM 方法进行方差分析，并用Duncan′s 法［1］进行多重比较，两组间比较采用t 检验，以P＜0.05 为差异显著。

2 结果与分析

2.1 色氨酸含量测定单因素试验结果

2.1.1 微波水解温度对色氨酸含量测定的影响采用5 mol/L 氢氧化钠溶液作为水解液，水解时间30 min，研究140、150、160、170、180 ℃水解温度对色氨酸含量的影响。 结果表明， 随着测定温度从140 ℃升高至180 ℃，色氨酸含量逐渐增加（见图1），当水解温度≥160 ℃时，TMR 色氨酸含量均显著（P≤0.05）高于140 ℃时测定结果。 虽然水解温度升至180 ℃后TMR 色氨酸含量仍有一定增加，但增幅明显下降， 且由于温度过高容易导致碱液过沸损失及水解管爆裂， 选择170 ℃为色氨酸测定最佳水解温度。

2.1.2 微波水解时间对色氨酸含量测定的影响如图2 所示，在以5 mol/L 氢氧化钠溶液作为水解液，提取温度170 ℃条件下，水解时间在10～30 min时，色氨酸含量迅速升高，水解效率增加，30 min时TMR 色氨酸含量均显著（P≤0.05）高于其他各时间点，40 min 时色氨酸含量逐渐降低，表明色氨酸在微波照射时间延长后可能发生部分分解［10］。选择30 min 为最佳水解时间。

2.1.3 微波水解碱浓度对色氨酸含量测定的影响在水解温度170 ℃，水解时间30 min 条件下，分别选取3、4、5、6 mol/L 的氢氧化钠作为水解液，不同碱浓度对色氨酸含量的影响见图3。 随着碱浓度的增大，色氨酸含量增加，当碱浓度为5 mol/L 时，色氨酸的含量达到最大值， 继续增加碱浓度时，TMR 色氨酸含量显著（P≤0.05）降低。由此确定水解液最佳碱浓度为5 mol/L。

2.2 色氨酸含量测定正交试验结果

图1 微波水解温度对饲料色氨酸含量测定的影响

图2 微波水解时间对饲料色氨酸含量测定的影响

2.2.1 色氨酸含量测定正交试验极差R 值结果正交试验极差R 值结果见表2。 影响TMR 色氨酸含量的各因素主次顺序为A＞C＞B，说明水解温度对TMR 色氨酸含量影响最大，与Zhang 等［11］认为水解温度对氨基酸水解效率影响最大的研究结果一致。 色氨酸含量测定最优组合为A3B2C3，即水解温度170 ℃、水解时间30 min、碱浓度5 mol/L 效果最佳。

2.2.2 色氨酸含量测定正交试验方差分析结果正交试验方差分析结果见表3。 水解温度、水解时间、碱浓度3 个因素对TMR 色氨酸含量的影响均达到极显著水平（P＜0.01）。 通过对比偏差平方和、均方可知，A 因素（水解温度）是影响饲料色氨酸含量测定最主要的因素，与“2.2.1”项下极差R 值分析结果一致。

2.3 色谱条件

氨基酸自动分析仪最佳工作条件：色谱柱为水解氨基酸分析柱LCAK06/Na （4.6 mm×150 mm）；检测器：570 nm 波长检测器；流动相：柠檬酸钠A 0.12 mol/L，pH 值3.45， 柠檬酸钠B 0.2 mol/L，pH值10.85；流动相流速：0.45 mL/min；茚三酮流速：0.25 mL/min；柱温：74 ℃；反应器温度：130 ℃；进样体积：50 μL。色氨酸标准品及样品色谱图见图4和图5。

2.4 线性关系及定量限

采用色氨酸标准储备液（C=1.00 μmol/mL）进行校准曲线绘制。选取色氨酸含量分别为0.025、0.050、0.100、0.200、0.300、0.400、0.500、0.600 mol/mL 的8个浓度点，以色氨酸含量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘制工作曲线（见图6）。 色氨酸的线性方程为Y=76 138.854 3X， 相关系数r=0.999 7，完全符合实验室要求。 结果表明： 色氨酸在0.025～0.600 μmol/mL 浓度范围内峰面积与浓度线性关系良好。 以10 倍噪音水平对应浓度确定定量限，该方法定量限为0.05%。

图3 氢氧化钠溶液浓度对饲料色氨酸含量的影响

表2 TMR 色氨酸含量测定正交试验结果

表3 TMR 色氨酸含量测定正交试验方差分析

图4 色氨酸标准品色谱图

表4 饲料色氨酸含量精密度测定结果 单位：%

图5 饲料样品色氨酸色谱图

图6 饲料色氨酸含量线性关系图

2.5 精密度

对TMR 饲料进行样品前处理后，在相同条件下平行进样6 次， 精密度试验平均值为0.14%，RSD 为3.58%，详细结果见表4。 这表明该试验精密度良好，能够准确测量色氨酸含量。

2.6 回收率

加标回收率结果见表5，TMR 色氨酸回收率93%～104%，平均值为98%。

2.7 方法对比

由表6 可知，微波碱水解法与国家标准《饲料中色氨酸的测定》（GB/T 15400—2018） 中的常规碱水解法相比具有相近的回收率， 且经过t 检验比较， 两种方法测定色氨酸含量结果无显著差异（P＞0.05），表明微波碱水解法同样准确有效。

3 讨论

3.1 微波水解条件选择

水解是色氨酸含量分析的关键步骤， 水解质量的好坏直接影响分析结果的准确性［12］。 色氨酸在酸性条件下不稳定、易分解，在使用氨基酸自动分析仪进行测定时， 无法通过酸水解与其他氨基酸同步测出含量，一般通过碱性水解单独测定［13］。然而， 已有的国家标准及文献中色氨酸的水解方法多为常规碱水解法， 色氨酸微波碱水解法研究较少，水解温度、水解时间及NaOH 浓度等微波水解条件变动范围较大，且多为单因素试验，并未采用正交试验进行科学优化组合［14-16］。 水解温度低保证了色氨酸检测结果的准确性，但耗时过长；水解温度过高能大大缩短检测时间， 但色氨酸结构会被破坏。因此，该试验通过单因素试验和正交试验，筛选出5 mol/L NaOH、170 ℃、水解30 min 作为测定TMR 饲料样品色氨酸含量的最佳微波碱水解条件，线性关系良好，色氨酸回收率为93%～104%，精密度RSD 为3.58%，表明色氨酸检测结果准确，并未受到温度的影响。

3.2 微波碱水解法与常规碱水解法比较

采用国家标准《饲料中色氨酸的测定》（GB/T 15400—2018）中的常规碱水解法，使蛋白质在碱的作用下，充氮气密封，放入110 ℃恒温干燥箱，水解20 h 后形成单一色氨酸，该过程步骤繁琐、耗时长、劳动强度大且处理过程中色氨酸易损失［17］。微波水解的过程： 样品水解液在超高频电磁波作用下［18］，极性分子随微波频率快速变换取向，分子之间高速碰撞摩擦［19-20］，在密闭环境中迅速加热水解，不但克服了常规水解法缺陷，而且氨基酸的化学形式不变［21-22］，提高了反应速度和灵敏度。 该加热方式与传统的加热方式相比具有操作简单、样品水解快、节约能源、工作效率高和劳动强度小等优点［23-24］。 因此，研究微波碱水解法快速测定饲料色氨酸含量，有助于提高检测效率。

表5 饲料色氨酸回收率测定结果

表6 微波碱水解法与国标常规碱水解法TMR 色氨酸含量对比

4 结论

①测定饲料中色氨酸含量的最佳微波碱水解条件：水解温度170 ℃，水解时间30 min，碱浓度5 mol/L； 水解温度是影响饲料色氨酸含量的最主要因素。

②结合氨基酸自动分析仪钠离子流动相系统测定TMR 饲料中色氨酸含量为0.14%。 该方法线性关系良好，方法回收率和样品精密度较高。