添加不同乳酸菌对青贮玉米和青贮黑麦草发酵品质、有氧稳定性的影响

赵峻祥，李金库，王雪洋，刘 晨，孙奉召，李井春，魏国生，李雁冰

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163319）

青贮（silage）是在严格密闭的环境中，使青贮原料发酵足够长的时间， 在此期间保持其质量相对稳定的一种保鲜技术［1］。 青贮原料应选择易被好氧微生物损坏， 可以在厌氧条件下靠乳酸菌发酵得以长期保存的原料［2-3］。 营养价值、发酵品质和有氧稳定性是鉴定青贮饲料品质的重要指标，发酵品质通过pH 值、有机酸含量和微生物菌落数评定［4］。 大量研究表明，乳酸菌添加剂可以很好地改善青贮饲料的发酵品质， 使发酵过程中乳酸菌数量增多，在微生物群落中占据主导地位，使pH值快速降低，乳酸含量较乙酸含量高［5］。 Kharazian等［6］在玉米青贮饲料中分离出了抗真菌活性高的乳酸菌，可用作青贮饲料添加剂提高青贮品质，研究结果表明， 在青贮饲料中加入同型乳酸菌可以提高发酵品质。 Yuan 等［7］人在青贮饲料中添加同型乳酸菌使得乳酸含量高于对照组。 同型乳酸菌可以提高发酵品质， 但对有氧稳定性的提升作用并不显著，近年来，为了减少有氧稳定性差造成的饲料损失， 很多学者采用异型乳酸菌作为饲料添加剂［8-9］。 也有学者提出将同型、异型乳酸菌联合添加到青贮饲料中，可以在保证发酵品质良好的情况下，提高有氧稳定性［10-11］。Parvin 等［12］研究发现，向黑麦草和几内亚草中添加乳酸菌可以与附生乳酸菌进行竞争，通过菌落分析，几乎检测不到添加的乳酸菌以外的微生物。 基于此，该试验设置了添加同型乳酸菌和异型乳酸菌两个菌种进行青贮，添加的同型乳酸菌为乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici，PA）， 异型乳酸菌为短乳杆菌（Lactobacillus brevis，LB），研究单一添加和联合添加上述2 种菌对青贮饲料发酵品质和有氧稳定性的影响。

1 材料与方法

1.1 青贮的调制与贮存

选用乳熟期全株玉米和开花期黑麦草， 全株玉米经铡草机切碎至1～2 cm 直接青贮，黑麦草青贮前预干4～8 h 至干物质含量为30%～50%，再经铡草机切碎至1～2 cm 后青贮。 试验设置4 个组：添加自来水处理组，记为对照组；添加乳酸片球菌处理组，记为PA 组；添加短乳杆菌处理组，记为LB 组； 乳酸片球菌和短乳杆菌联合添加处理组，记为PA+LB 组。 将乳酸片球菌和短乳杆菌冻干粉末用自来水溶解稀释，以2 mL/kg 的剂量均匀喷洒在原材料上，以保证每克原料上的乳酸菌达到106CFU，对照组添加自来水2 mL/kg。 将处理好的原料300 g 放入0.05 mm 厚的塑料袋（27 mm×39 mm），利用真空封口机抽气封口，置于恒温环境（25 ℃）中发酵，保存在25 ℃恒温室内，贮存30 d。 每个处理3 个平行样本。 乳酸片球菌和短乳杆菌分离于发酵TMR。

1.2 化学成分及微生物菌落数分析

1.2.1 干物质含量测定DM 测定： 采用60 ℃，48 h 干燥法。

1.2.2 样品处理在30 d 开袋时取样，称取样品20 g， 放入实验用样品袋， 加180 mL 无菌生理盐水，密封，在摇床上以120 r/min 摇动10 min。 用3层无菌纱布过滤青贮草渣， 滤液用于青贮饲料的乙醇、乳酸、短链脂肪酸含量和pH 值的测定。

1.2.3 pH 值测定用梅特勒Ps-2 型酸度仪测定pH 值。

1.2.4 有机酸含量测定有机酸含量采用液相色谱法测定：将青贮滤液经0.20 μm 的过滤器过滤，取10 μL 过滤后的滤液加入色谱柱。 色谱条件为：色 谱 柱 ICSep COREGEL -87H column （Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., Tokyo, Japan）（8 μm，7.8 mm×100 mm）； 流动相0.004 mol/L 硫酸, 临用前用超声波脱气；流速0.6 mL/min；进样20 μL；温度60 ℃。

1.2.5 微生物菌落数分析乳酸菌的培养采用MRS 培养基， 酵母菌的培养采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基。 微生物菌落数采用微生物平板菌落计数法获得。

1.3 有氧稳定性试验

所有青贮饲料达到贮存日期后开封， 取出150 g 样本，放入500 mL 的无菌广口瓶，样本正中插入温度计，并敞口放置7 d，环境温度为25 ℃恒温。 每日2 次（6：00 和18：00）记录室温和所有样本的温度， 当样本的温度超过室温2 ℃时判定为样本腐败。 7 d 后检测pH 值和发酵产物，pH 值上升幅度小,有氧稳定性较好,反之则较差。

1.4 统计分析

利用IBM SPSS Statistics 19 软件方差分析中的Duncan′s 方法进行多重比较，判断数值间的差异性，P＜0.05 代表差异显著。

2 结果

2.1 全株玉米贮藏30 d 后的有机成分和微生物组成

由表1 可知，在青贮玉米贮藏30 d 后，各组pH 值均低于4.0。 各组乳酸含量无显著差异（P＞0.05）；LB 组和PA+LB 组乙酸值显著 （P＜0.05）高于其他组， 乙酸可以抑制青贮饲料中好氧微生物的活性，提高饲料的有氧稳定性，同时乙酸含量高会影响饲料的适口性；对照组和LB 组的乙醇含量显著（P＜0.05）高于PA 组和PA+LB 组，乙醇含量高会对青贮饲料的营养价值有一些不良影响；添加乳酸菌的3 个组乳酸菌数量显著（P＜0.05）高于对照组；LB 组和PA+LB 组酵母菌数量低于对照组和PA 组（P＜0.05），酵母菌数量高不利于改善青贮饲料的发酵品质。

2.2 乳酸菌对青贮玉米有氧稳定性的影响

通过有氧稳定性试验可知（见表2），对照组在开封后1 d 腐败，PA 组和LB 组分别在2 d 和2.5 d 腐败；PA+LB 组5 d 后腐败， 与其他组相比延后。

经过7 d 有氧稳定性试验， 与表1 中对应的各个指标比较，各组pH 值显著（P＜0.05）增加；各组乳酸、乙酸和乙醇含量明显降低（P＜0.05）。 由表3 可知，PA+LB 组pH 值显著（P＜0.05）低于其他各组，乳酸含量显著（P＜0.05）高于其他各组；乳酸菌和酵母菌数量各组无显著差异（P＞0.05）。

表1 全株玉米贮藏30 d 后青贮饲料成分分析

表2 各组玉米青贮饲料有氧稳定性分析 单位：d

表3 有氧稳定性试验后的青贮玉米饲料成分分析

表4 黑麦草贮藏30 d 后青贮饲料成分分析

2.3 黑麦草贮藏30 d 后的有机成分和微生物组成

由表4 可知，对照组pH 值显著（P＜0.05）高于其他各组；PA 组乳酸含量显著（P＜0.05）高于其他各组；LB 组和PA+LB 组乙酸含量高于其他各组；PA 组乙醇含量显著（P＜0.05）低于其他各组；LB 组和PA+LB 组未检测到酵母菌，乳酸菌数量低于对照组和PA 组（P＜0.05）。

2.4 乳酸菌对青贮黑麦草有氧稳定性的影响

由表5 可知， 对照组青贮饲料在2 d 后发生腐败； 添加乳酸菌的各试验组青贮饲料的有氧稳定性都大于7 d，有氧稳定性好。

经过7 d 有氧稳定性试验，与表4 比较，对照组pH 值因为腐败而增加（P＜0.05），乳酸含量升高（P＜0.05），乙醇含量降低（P＜0.05）；添加乳酸菌的各组pH 值无明显变化，乳酸含量增加（P＜0.05），乙醇含量降低（P＜0.05）。 由表6 可知，添加乳酸菌的各组pH 值显著（P＜0.05）低于对照组，乳酸含量显著 （P＜0.05） 高于对照组；LB 组乙酸含量显著（P＜0.05）高于其他各组，可能是由于LB 为异型乳酸菌，主要产物为乙酸；乳酸菌数量各组无显著差异（P＞0.05）；对照组酵母菌数量显著（P＜0.05）高于PA 组，LB 组和PA+LB 组未检测到酵母菌。

表5 各组黑麦草青贮饲料有氧稳定性分析 单位：d

3 讨论

3.1 乳酸菌添加剂对青贮玉米发酵品质和有氧稳定性的影响

该试验中， 全株玉米发酵30 d 后各组pH 值都低于4.0，青贮效果良好；各添加乳酸菌的试验组乳酸菌数量显著高于对照组；PA 组和联合添加组乙醇含量显著低于LB 组和对照组，主要原因是由于PA 属于同型乳酸菌， 可以显著降低乙醇含量。各组乳酸含量无显著差异，乳酸含量是决定青贮饲料品质的重要因素［13］，该结果说明乳酸菌添加剂对青贮玉米品质的提升无显著作用， 这可能是因为玉米自身的可溶性糖（WSC）含量高，为乳酸菌提供充足的发酵底物，可以产生大量乳酸，即使不使用乳酸菌添加剂， 也可以保证产出足够多的乳酸［14］。PA 组乙酸含量和酵母菌数量都与对照组无显著差异， 主要是由于同型乳酸菌主要产物为乳酸，产生可以抑制酵母菌的短链脂肪酸很少。LB 组的乙酸含量显著高于对照组，酵母菌数量显著低于对照组， 这是因为异型乳酸菌主产物为乙酸，乙酸可以抑制酵母菌的生长，对提高青贮饲料有氧稳定性有一定帮助［15］，但乙酸含量高会降低饲料的适口性。 在有氧稳定性试验中，PA 组在2 d后就出现腐败， 这是因为同型乳酸菌产生的乙酸较少，不能很好地抑制酵母菌和霉菌，与Muck［16］和Conaghan 等［17］的报道一致；LB 组在2.5 d 后pH 值上升，出现腐败，说明通过在青贮玉米中单独添加异型乳酸菌提高饲料有氧稳定性结果并不理想。 很多研究表明同型乳酸菌降低了青贮饲料的有氧稳定性， 但与异型乳酸菌联合作用时则改善了青贮饲料的有氧稳定性。 张涛等［18］研究表明在苜蓿中添加青贮菌剂，有效提高了有氧稳定性。魏日华［19］研究表明，在无芒燕麦中添加不同乳酸菌对于青贮有氧稳定性的提高有明显作用。 上述试验受菌种搭配和原料影响， 对于提高青贮的有氧稳定性效果不同，但结果类似。该试验中青贮玉米联合添加组在5 d 后才腐败， 乳酸含量显著高于其他各组，这是因为乙酸在前期被消耗，为乳酸菌提供了充足的发酵底物，有氧暴露后，乳酸含量仍然升高，且pH 值低于4.5，有氧稳定性优于其他添加组，说明PA 和LB 联合添加对青贮玉米有氧稳定性有一定的改善作用。

3.2 乳酸菌添加剂对青贮黑麦草发酵品质和有氧稳定性的影响

该试验中的青贮黑麦草在发酵30 d 后，添加乳酸菌的各组pH 值与对照组相比都显著降低，说明在黑麦草中添加乳酸菌对于降低pH 值有显著作用。 添加同型乳酸菌PA 的PA 组，乳酸菌和酵母菌与对照组差异不显著； 乳酸含量为各组中最高，乙醇含量为各组中最低；乙酸含量低于其他乳酸菌添加组，可以增加青贮饲料的适口性。 PA 单独添加和联合添加对于黑麦草发酵品质都有一定的改善作用。 在有氧稳定性试验中，PA 组、LB 组和PA+LB 组的黑麦草都在7 d 后才出现腐败，且各组pH 值显著低于对照组，在青贮黑麦草中单独添加PA，也可使有氧稳定性增强，但在青贮玉米中并没有显效， 可能与青贮原料不同或是原料自身附着的微生物不同有关； 在黑麦草有氧稳定性试验中，PA 组有氧稳定性同LB 组、PA+LB 组无差别，但仍能检测出酵母菌，其抑制腐败能力不如LB 组和PA+LB 组强大；在有氧稳定性试验后，LB组乙酸含量显著高于其他各组， 乙酸过高导致饲料适口性降低，影响动物生产力，这也是异型乳酸菌的弱点；而PA+LB 组，在有氧稳定性试验后，抑制腐败的能力与LB 组类似，但乙酸含量显著低于LB 组，乳酸含量高于PA 组，说明两种乳酸菌联合添加时具有协同作用， 在保证具有较高乳酸含量的同时还能提高有氧稳定性。

4 结论

乳酸片球菌和短乳杆菌联合添加对青贮玉米的有氧稳定性具有一定的改善作用； 单独添加乳酸片球菌对青贮黑麦草发酵品质的改善效果最优； 向青贮黑麦草中联合添加乳酸片球菌和短乳杆菌既可以保证良好的氧稳定性， 还能改善饲料发酵品质。