Transwell小室共培养条件下微血管内皮细胞对成骨细胞增殖、凋亡的影响

李高志，张丽君，王艺璇，徐丽群，胡泽兵，石 菲，张 舒，曹新生

空军军医大学 航空航天医学系，航空航天医学教育部重点实验室，陕西西安 710032

骨质疏松的治疗和骨折修复是临床关注的热点，如何促进和维持骨的生成是需要重点解决的问题。近年来的研究发现，在骨骼的生长发育和修复重建过程中，血管新生与骨形成密切相关[1-3]。骨骼中的血管系统能够运输营养物质、氧气和代谢废物，同时骨骼内的微血管内皮细胞还可以分泌细胞因子调节成骨细胞的功能和新骨形成[4-5]。相应的，成骨细胞也可以分泌多种细胞因子调节微血管内皮细胞的功能和血管新生[6-7]。因此，探究微血管内皮细胞与成骨细胞之间的相互调控，将为促进骨骼的生长发育和修复重建提供新的思路。细胞共培养指两种或多种细胞在同一种培养条件下共同培养，可更好地模拟体内环境，这种方法被广泛应用于细胞间相互调控的研究[8]。构建微血管内皮细胞与成骨细胞的共培养体系，可以更加真实地模拟骨骼生长发育和修复重建过程中骨微血管内皮细胞与成骨细胞的相互作用，也是血管化组织工程骨中常见的细胞组合类型[9]。本研究选取小鼠成骨细胞MC3T3-E1和小鼠微血管内皮细胞bEnd.3作为研究材料，采用非接触共培养的方式建立MC3T3-E1/bEnd.3共培养体系，旨在观察bEnd.3细胞通过旁分泌途径对MC3T3-E1细胞增殖和凋亡功能的影响。

材料和方法

1 材料 小鼠成骨细胞系MC3T3-E1(购于中国科学院上海细胞库)，小鼠微血管内皮细胞bEnd.3(购于中国科学院上海细胞库)，DMEM高糖培养基(Gibco公司)，α-MEM培养基(Gibco公司)，青-链霉素双抗溶液(Hyclone公司)，胎牛血清(Gibco公司)，胰蛋白酶(Millipore公司)，Transwell小 室(0.4µm孔 径，Millipore公 司)，CCK-8试剂盒(日本同仁化学研究所)，Annexin VFITC/PI试剂盒(BioVision公司)，PI试剂盒(碧云天公司)，M-PER哺乳动物蛋白抽提试剂(Thermo Fisher Scientific公司)，细胞增殖核抗原(PCNA)一抗(1∶1 000，Cell Signaling Technology公司)，Bcl-2相关X蛋白(Bax)一抗(1∶1 000，Cell Signaling Technology公司)，Caspase-3一抗(1∶1 000，Cell Signaling Technology公 司)，GAPDH一 抗(1∶5 000，Proteintech公司)，二抗(1∶5 000, ZSGBBIO公司)，ECL发光检测试剂盒(Merck Millipore公司)，PBS缓冲溶液(Gibco公司)，流式细胞仪(BD公司)，酶标仪(Bio-Rad公司)，化学发光仪( Tanon-4 200，上海天能科技有限公司)。

2 MC3T3-E1细胞的培养 将冻存的小鼠成骨细胞MC3T3-E1细胞复苏后，使用含有10%胎牛血清和1%青-链霉素双抗的α-MEM培养基进行培养，将细胞置于37℃孵箱中，保持5% CO2浓度，每2 d换液1次。当细胞的汇合度达到约90%时，使用胰蛋白酶进行消化、传代处理。选取复苏后3 ～ 6代处于对数生长期的细胞进行单独培 养或共培养。

3 bEnd.3细胞的培养 将冻存的小鼠微血管内皮细胞bEnd.3细胞复苏后，使用含有10%胎牛血清和1%青-链霉素双抗的DMEM高糖培养基进行培养，将细胞置于37℃孵箱中，保持5% CO2浓度，每2 d换液1次。当细胞的汇合度达到约80%时，使用胰蛋白酶进行消化、传代处理。选取复苏 后3 ～ 6代处于对数生长期的细胞进行共培养。

4 MC3T3-E1/bEnd.3细胞共培养体系的建立 取复苏后3 ～ 6代生长状态良好的MC3T3-E1细胞，胰酶消化制成单细胞悬液，进行细胞计数，将细胞密度调整至2×105/mL后将1 mL细胞悬液均匀接种于6孔板。利用孔径0.4 µm的Transwell小室建立非接触的细胞共培养系统。取复苏后3 ～ 6代生长状态良好的bEnd.3细胞，胰酶消化制成单细胞悬液，进行细胞计数，将细胞密度调整至2×105/mL后 将1 mL细 胞 悬 液 均 匀 接 种于Transwell小室内底面。然后将接种有bEnd.3细胞的Transwell小室插入接种有MC3T3-E1细胞的6孔板中，建立MC3T3-E1和bEnd.3的1∶1比例的细胞共培养体系。单独培养的MC3T3-E1细胞，孔中不置入小室。两者均使用共培养培养基(DMEM高糖培养基与α-MEM培养基混合，比例为1∶1，含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液)，置于37℃孵箱中，保持5% CO2浓度，每2 d换 液1次。

5 实验分组 对照组：单独培养MC3T3-E1细胞；共培养组：MC3T3-E1细胞 + bEnd.3细胞，实 验重复3次。

6 CCK-8法检测MC3T3-E1细胞活性 分别于0 h、24 h、48 h、72 h移去小室，取出两组细胞，弃上清液，每孔中加入1 mL新鲜培养基和CCK-8试剂100 µL，于37℃孵箱中孵育2 h，然后将反应后的溶液转移至96孔板中，使用酶标仪检测450 nm处的吸光值。以6孔板的每孔细胞作为1 次生物学重复，本实验共进行了3次重复。

7 PI单染流式细胞术检测MC3T3-E1细胞周期 在细胞培养48 h后，移去小室，取出两组细胞，胰酶消化后，制成单细胞悬液，离心(1 000 r/min，5 min)，弃上清后，PBS洗涤，离心(1 000 r/min，5 min)，弃掉PBS后，加入1 mL PBS和2 mL无水乙醇固定，4℃过夜。取出固定好的细胞，参照试剂盒说明书配置反应溶液，加入细胞，避光10 min后，流式细胞仪检测并分析MC3T3-E1细胞 周期分布。

8 Annexin V-FITC/PI双 染 流 式 细 胞 术 检测MC3T3-E1细胞凋亡率 在细胞培养48 h后，移去小室，取出两组细胞，胰酶消化后，制成单细胞悬液，离心(1 000 r/min，5 min)，弃上清后，PBS洗涤，离心(1 000 r/min，5 min)，弃掉PBS后，加入PBS溶液重悬细胞，参照Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒配置反应溶液，标记细胞，用流式细 胞仪检测MC3T3-E1细胞凋亡率。

9 Western blotting检测MC3T3-E1细胞增殖、凋亡相关蛋白的表达变化情况 在细胞培养48 h后，移去小室，胰酶消化后，收集细胞并裂解，提取细胞总蛋白，并进行BCA定量。按30～50 µg的蛋白量加样，经SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，5%脱脂牛奶封闭，一抗(PCNA为1∶1 000，Bax为1∶1 000，Caspase-3为1∶1 000，GAPDH为1∶5 000)，4℃孵育过夜后，洗膜，山羊抗兔HRP标记的二抗(1∶5 000)孵育2 h，ECL化学发光后，使用凝胶成像仪观察拍照，利用Image J软件 进行定量分析。

10 统计学方法 采用统计软件SPSS22.0进行分析。实验数据均为计量资料，以 x¯ ±s表示，两样本间比较采用独立样本t检验。P ＜ 0.05为差异有统计 学意义。

结 果

1 共培养条件下微血管内皮细胞促进成骨细胞的增殖 在共培养0 h、24 h、48 h、72 h的4个时间点，对两组MC3T3-E1细胞样本进行CCK-8检测(图1)。从生长曲线可以看出，对照组和共培养组MC3T3-E1细胞的细胞活性均随着时间延长而增加，但共培养组MC3T3-E1细胞的细胞活性增加更明显，并且在共培养48 h和72 h两个时间点两组差异有统计学意义(P ＜ 0.05)。PI单染流式细胞术的检测结果表明(图2)，与bEnd.3共培养之后，MC3T3-E1细胞周期中3个时期的比例出现显著变化。与对照组相比，共培养组MC3T3-E1细胞的G1期细胞比例显著下降(P ＜ 0.01)，S期的细胞比例显著增高(P ＜ 0.01)，G2/M期的细胞比例显著增高(P ＜ 0.05)，结果提示共培养条件下bEnd.3能够显著促进MC3T3-E1细胞的增殖功能。Western blotting的结果证实(图3)，与bEnd.3共培养之后，MC3T3-E1细胞的PCNA蛋白表达水平显著升高(P ＜ 0.01)，表明MC3T3-E1细胞的增殖 能力较对照组显著增强。

图 1 CCK-8检测共培养条件下，bEnd.3对MC3T3-E1细胞活性的影响 (aP＜0.05，vs 对照组)Fig.1 Effect of coculture with bEnd.3 on cell viability of MC3T3-E1 by CCK-8 assay (aP＜0.05, vs control group)

图 2 流式细胞仪检测共培养条件下，bEnd.3对MC3T3-E1细胞周期的影响 (aP＜0.05，bP ＜0.01，vs 对照组)F ig.2 Effect of coculture with bEnd.3 on MC3T3-E1 cell cycle by flow cytometry (aP＜0.05, bP ＜0.01, vs control group)

2 共培养条件下微血管内皮细胞抑制成骨细胞的凋亡 Annexin V-FITC/PI双染流式细胞检测结果表明(图4)，与bEnd.3共培养之后，MC3T3-E1细胞的凋亡率显著下降(P ＜ 0.05)。采用Western blotting检测凋亡相关因子Bax、Cleaved Caspase-3的表达变化(图5)，结果显示，与对照组相比，共培养组MC3T3-E1细胞Bax、Cleaved Caspase-3的表达水平显著降低(P ＜ 0.05)。上述结果提示，在Transwell共培养条件下，bEnd.3能够抑制MC3T3-E 1细胞的凋亡。

图 3 Western blotting检测PCNA蛋白的表达 (bP＜0.01，vs 对照组)Fig.3 PCNA protein expression detected by Western blotting(bP＜0.01, vs control group)

图 4 流式细胞仪检测共培养条件下，bEnd.3对MC3T3-E1细胞凋亡的影响 (aP＜0.05， vs 对照组)F ig.4 Effect of coculture with bEnd.3 on apoptosis of MC3T3-E1 by flow cytometry (aP＜0.05, vs control group)

图 5 Western blotting 检测共培养条件下MC3T3-E1细胞中Bax和Cleaved Caspase-3蛋白的表达 (aP＜0.05，vs 对照组)F ig.5 Western blotting detection of Bax and Cleaved Caspase-3 protein expression (aP＜0.05, vs control group)

讨 论

在骨骼的生长发育及修复重建中，血管新生与骨形成是两个密切相关的过程。近年来的研究发现，在骨骼愈合过程中，成骨细胞选择性地分布于骨内微血管内皮细胞周围，提示成骨细胞与微血管内皮细胞之间可能通过细胞间通讯调控血管新生与骨形成[3-4,10]。

细胞共培养技术为探究成骨细胞与内皮细胞的相互调控，并构建血管化组织工程骨提供了便利条件。目前，根据实验目的的不同，可以采用两种方式建立细胞共培养体系[11-12]。一是直接接触共培养，即将两种细胞接种于同一载体上，不同种类的细胞之间可以直接接触。这种方法能够观察两个相邻细胞之间的直接相互作用[13]，如细胞间黏附和缝隙连接。二是间接接触共培养，通常采用Transwell小室来进行实验，通过培养基质内营养物质的交流来实现细胞之间的交流，从而使细胞拥有共同的培养环境[14]。这种方法能够观察两种细胞之间的旁分泌相互作用。其中，Transwell小室共培养技术是较为成熟且应用较多的实验方法。在内皮细胞与成骨细胞的共培养体系中，内皮细胞根据脉管来源可以分为大血管内皮细胞和微血管内皮细胞两种类型[15-16]。大血管内皮细胞中最常用的是脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)[17]。Han 等[18]构建HUVEC/MC3T3-E1共培养体系，发现MC3T3-E1的ALP活性和矿化结节数目显著提高，成骨分化功能显著增强。此外，Dariima等[19]利用原代主动脉内皮细胞与MC3T3-E1建立共培养体系，证实MC3T3-E1细胞中ALP、OCN、OPN以及Col I的表达水平显著升高，成骨分化功能增强。Lee等[20]证实主动脉内皮细胞的细胞外基质能够保持骨髓间充质干细胞的形态，并维持其分化潜能和增殖能力。研究表明，与大血管内皮细胞相比，微血管内皮细胞能够更加真实地模拟骨骼系统中微血管内皮细胞对成骨谱系细胞的调控作用[21]。但由于骨微血管内皮细胞含量稀少，导致其分离纯化受到很大制约。目前，在体外细胞学实验中，微血管内皮细胞通常从非骨组织中获取，作为骨微血管内皮细胞的替代细胞。Laranjeira等[22]把人真皮微血管内皮细胞(human dermal microvascular endothelial cells，HDMEC)与人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells，HMSC)按照4：1的比例混合，构建HDMEC/HMSC共培养体系，发现HMSC的ALP活性和矿化结节数目显著增多，其成骨分化功能显著增强。Ribeiro等[16]利用HDMEC与HMSC建立直接共培养体系，证实在双磷酸盐的诱导下，共培养组HMSC的ALP、OCN、OPG和BMP-2表达水平显著升高，且ALP活性显著增强。

本研究利用Transwell小室，构建bEnd.3/MC3T3-E1共培养体系。bEnd.3是一种小鼠脑组织来源的微血管内皮细胞。研究表明，其具备多种典型的微血管内皮细胞的特征，是微血管内皮细胞相关研究中可靠的细胞模型[23-24]。已有研究表明，bEnd.3微血管内皮细胞与骨骼细胞的功能密切相关。Song等[25]以bEnd.3细胞为研究对象，发现bEnd.3细胞来源的外泌体能够抑制破骨细胞形成，从而抑制骨吸收，且具有良好的骨靶向性和生物相容性。但bEnd.3细胞与成骨细胞的共培养研究尚未见报道。本研究首次采用非接触共培养的方式建立MC3T3-E1/bEnd.3共培养体系，发现与单独培养的MC3T3-E1细胞相比，共培养组MC3T3-E1细胞的增殖活性显著增强，且S期和G2/M期细胞比例显著升高，PCNA表达水平显著上调。同时，共培养组MC3T3-E1细胞的凋亡率显著下降，Bax、Cleaved Caspase-3表达水平降低。这些结果表明，在非接触共培养条件下，bEnd.3细胞能够显著促进MC3T3-E1细胞的增殖，并抑制其凋亡。既往研究主要关注在共培养条件下，内皮细胞对成骨谱系细胞分化、矿化功能的调控[15,26-27]，而较少关注对其增殖、凋亡的影响，本研究拓宽了内皮细胞对成骨细胞功能调控的认识。研究表明，内皮细胞可以分泌多种可溶性细胞因子调控成骨细胞、骨祖细胞以及骨髓间充质干细胞的功能，如内皮素-1、骨形态发生蛋白和成纤维细胞生长因子等[28-31]。我们推测bEnd.3细胞可能通过旁分泌途径调控MC3T3-E1细胞的增殖及凋亡，但具体的分子机制尚未阐明，仍需进一步研究。

综上所述，在Transwell小室共培养条件下，微血管内皮细胞bEnd.3能够显著促进成骨细胞MC3T3-E1的增殖，并抑制其凋亡。这为防治骨质疏松、构建血管化组织工程骨选择合适的微血管内皮细胞提供了理论依据，并进一步加深了微血管内皮细胞对成骨细胞功能调控的理解。但细胞间具体的调控机制尚未明确，值得进一步探讨。