急性脊髓损伤后炎症反应、自噬和凋亡相关因子的变化以及JAK2/STAT3信号通路研究

彭 成，刘佩雷，陶 钧，张 乐，陶奇昌，代建昊，李 强

急性脊髓损伤(Acute Spinal Cord Injury，ASCI)分为急性期(2周内)和慢性期(2周～6个月)病理改变，其中急性期临床症状以机械性脊髓神经结构破坏为主[1]，如感觉、运动功能下降或丧失，部分患者急性期神经缺失症状可能不明显，导致治疗延误。而持续的炎症反应、神经细胞凋亡将进一步加重神经细胞的功能丧失，这是导致ASCI后神经功能永久性障碍的重要原因之一[2]。研究发现，ASCI急性期和慢性期均可观察到自噬活性的增强，且与神经细胞的功能障碍有关[3]。JAK2/STAT3信号通路是真核生物体内调控多种细胞因子和生长因子表达以及细胞增殖、分化和凋亡的重要细胞内途径之一，同样也参与ASCI的发生发展过程[4]。基于此，本研究观察大鼠ASCI后神经细胞炎症、自噬、凋亡相关因子的表达水平，揭示其JAK2/STAT3信号通路活化机制，从而为ASCI的靶向治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和设备 主要仪器：光学显微镜和荧光显微镜购自日本奥林巴斯公司，蛋白电泳仪、超声溶解仪购自北京六一厂，PVDF膜购自美国R&D公司。主要试剂：兔抗大鼠白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、热休克蛋白-27(Heat Shock Protein-27，HSP-27)单克隆抗体一抗及羊抗兔对应抗体二抗，辣根酶标记链霉卵白素工作液均购自江苏碧云天科技有限公司；BCA蛋白定量检测试剂，兔抗大鼠JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Caspase-3、Bax/Bcl-2蛋白和β-actin抗体一抗及羊抗兔对应抗体二抗均购自美国Sigma公司；兔抗大鼠微管相关蛋白1轻链3(Microtubule-Associated Protein1 Light Chain 3，MAP1LC3)-Ⅱ抗体一抗及羊抗兔对应抗体二抗均购自北京中杉金桥生物有限公司；Lab Works 4.5凝胶成像软件购件美国Invitrogen公司。

1.2 实验动物 选择健康成年8～10周龄SD雄性大鼠45只，体质量(245±25)g，购自上海生工动物实验中心(动物许可证号：沪2018-04-012)，适应性饲养1周后进入实验。

1.3 分组 将45只大鼠随机分为假手术组、模型组和JAK2抑制剂AG-490干预组，每组各15只。假手术组仅切开T9全椎板，不损伤脊髓。模型组采用改良Allen法[5]复制ASCI模型(大鼠出现摆尾反射、双下肢和躯体回缩样扑动、清醒后双下肢呈弛缓性瘫痪视为造模成功)；AG-490干预组将AG-490溶于45%甲基亚枫溶剂中，在复制ASCI模型(与模型组同法)前20 min经腹腔注入。

1.4 检测指标 参考Delgado[5]研究分别于损伤后6、12和24 h处死大鼠(每组每个时间点各5只)，检测脊髓组织中IL-6、TNF-α、HSP-27分子和MAP1LC3-Ⅱ的阳性表达率，以及JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白和Caspase-3、Bax/Bcl-2蛋白的表达水平。

1.4.1 免疫组化染色 大鼠麻醉、打开胸腔、切开右心耳、4%多聚甲醛固定40 min，经背部切口钝性剥离脊髓，获取以损伤段为中心、长约1 cm的脊髓组织。常规制作脊髓组织切片，厚度5 μm，处理后滴加兔抗大鼠IL-6、TNF-α和HSP-27单克隆抗体一抗(工作浓度1∶2 000)，置于湿盒内4 ℃孵育过夜，以正常大鼠IgG代替一抗作为阴性对照；PBS溶液洗涤后滴加羊抗兔对应抗体二抗(工作浓度1∶500)，置于湿盒中27 ℃孵育20 min；PBS溶液洗涤后滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液置于湿盒中27 ℃孵育20 min；PBS溶液洗涤、DAB显色后封片观察。结果判定：每张切片选择上、下、左、右和中央5个视野，以细胞核或胞浆黄染为阳性细胞，计算阳性细胞占视野中所有细胞的百分比，结果取平均值。

1.4.2 Western Blot法检测 将获取的脊髓组织剪成小片状多次离心，超声碎解后加入BCA蛋白定量检测试剂，经内参β-actin抗体进行剂量标准化。取30 μg样品蛋白和等量标准蛋白，于8%SDS-PAGE电泳分离，将分离区带电转移至PVDF膜；滴加兔抗大鼠JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Caspase-3、Bax/Bcl-2蛋白和β-actin抗体一抗(工作浓度1∶2 000)静置过夜；PBS溶液洗涤后滴加羊抗兔对应抗体二抗(工作浓度1∶500)室温孵育4 h；PBS溶液洗涤、ECL显色，结果扫描保存，采用Lab Works4.5凝胶成像软件进行半定量分析，以目标蛋白与内参蛋白电泳条带灰度值的比值为最终结果。

1.4.3 免疫荧光标记法检测 脊髓组织切片经前期处理(同1.4.1)后，滴加兔抗大鼠MAP1LC3-Ⅱ抗体一抗(工作浓度1∶500)4 ℃孵育过夜；PBS溶液洗涤后滴加荧光标记羊抗兔抗体二抗(工作浓度1∶500)4 ℃孵育过夜；PBS溶液洗涤后DAPI染色2 min，避光条件下采用荧光显微镜观察。于400倍视野下选择上、下，左、右和中央共5个区域，计算MAP1LC3-Ⅱ阳性细胞数百分比。

2 结果

2.1 三组各时间点脊髓组织IL-6、TNF-α和HSP-27分子阳性表达率 与假手术组比较，模型组各时间点脊髓组织IL-6、TNF-α和HSP-27阳性表达率增加(P<0.05)，而干预组各时间点上述指标低于模型组(P<0.05，图1，图2)。

图1 脊髓组织IL-6、TNF-α和HSP-27分子阳性表达(免疫组化染色×100)

图2 三组各时间点脊髓组织IL-6、TNF-α和HSP-27分子阳性表达率比较模型组同时间点与假手术组比较，#P<0.05；干预组同时间点与模型组比较，*P<0.05

2.2 三组各时间点脊髓组织JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表达水平 与假手术组比较，模型组各时间点脊髓组织p-JAK、p-STAT3蛋白表达水平增加，而干预组各时间点上述指标均低于模型组(P<0.05)；三组各时间点脊髓组织JAK2、STAT3总蛋白表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05，图3、图4)。

图3 JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3和β-actin蛋白表达

图4 三组各时间点脊髓组织JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表达水平的比较模型组同时间点与假手术组比较，#P<0.05；干预组同时间点与模型组比较，*P<0.05

2.3 三组各时间点脊髓组织MAP1LC3-Ⅱ阳性表达率 与假手术组比较，模型组各时间点组织MAP1LC3-Ⅱ阳性表达率增加，而干预组各时间点均低于模型组(P<0.05，图5，图6)。

图5 脊髓组织MAP1LC3-Ⅱ阳性表达(×400)

图6 三组各时间点脊髓组织MAP1LC3-Ⅱ阳性表达率比较模型组同时间点与假手术组比较，#P<0.05；干预组同时间点与模型组比较，*P<0.05

2.4 三组各时间点脊髓组织Caspase-3和Bax/Bcl-2蛋白表达水平 与假手术组比较，模型组各时间点组织Caspase-3和Bax/Bcl-2蛋白表达水平均增加，而干预组各时间点上述指标均低于模型组(P<0.05，图7)。

图7 三组各时间点脊髓组织Caspase-3和bax/bcl-2蛋白表达水平比较模型组同时间点与假手术组比较，#P<0.05；干预组同时间点与模型组比较，*P<0.05

3 讨论

继发神经细胞功能障碍是ASCI的主要病理机制，也是改善患者生存预后的重要靶点。根据既往报道，炎症反应、细胞凋亡和自噬行为在ASCI继发神经细胞功能障碍的发生和发展过程中扮演重要角色。揭示ASCI后实验动物脊髓组织的炎症反应、细胞凋亡和自噬相关因子的水平，同时观察靶向干预JAK2/STAT3信号通路对上述病理过程的影响，对于理解疾病发生机制以及提供针对性干预位点具有重要意义。

3.1 ASCI后神经细胞炎症反应相关因子变化 早期炎症反应的敏感标志物有IL-6、TNF-α和HSP-27等[6]。HSP-27是细胞在缺氧、应激环境下大量表达的一种损伤修复分子，主要发挥“分子伴侣”的功能，在不同细胞局部环境诱导下，发挥不同的生物学效应。也就是说，HSP-27既可降低损伤细胞DNA折叠错误率、增强细胞抵御损伤因素的能力，又可激活细胞周期分裂，促使细胞DNA错配和异常蛋白的翻译和表达[7]。Boraiah等[8]研究指出，与第0天比较，第30天HSP-27表达显著下调，HSP-27可能在脊髓损伤中发挥重要作用。Nasouti等[9]研究指出，海藻糖可以通过调节HSP-27和HSP-70及Caspase-3基因的表达来保护脊髓免受损伤。

本研究结果发现，模型组6、12、24 h脊髓组织IL-6、TNF-α和HSP-27阳性表达率均高于假手术组，而干预组则低于模型组(P<0.05)，提示炎症反应紊乱参与了ASCI的发生过程，干预JAK2/STAT3信号通路能够抑制炎症反应，阻止ASCI进程。

需要强调的是，JAK2/STAT3信号通路的活化既需要炎症因子IL-6和TNF-α的诱导，同时又可加剧炎症因子的释放，形成炎症瀑布样级联反应伤[10]。因此，本研究观察到，除了假手术组，模型组和干预组IL-6、TNF-α和HSP-27阳性表达率随损伤时间的延长而不断升高，24 h内未观察到峰值出现，提示炎症反应可伴随ASCI发生的早期全过程，且随时间延长而程度加重[11]。

3.2 ASCI后神经细胞凋亡和自噬相关因子变化 凋亡机制在ASCI中也起到重要作用。凋亡下游多种途径的共同效应因子Caspase-3是蛋白酶级联反应的组成部分，主要通过对蛋白激酶、核酸酶及细胞骨架的裂解，产生核皱缩、DNA片段等凋亡现象，最终控制凋亡的发生和进程[12]，其表达水平可反映细胞凋亡的程度。Bax/Bcl-2比值则往往决定凋亡的方向，当抗凋亡分子Bcl-2/促凋亡分子Bax>50%时，细胞表现明显的抗凋亡效应[13]。Yuan等[14]研究指出，神经节苷脂能够抑制急性脊髓损伤大鼠Caspase-3的表达水平，进而提高神经生长因子浓度和改善脊髓损伤症状。Wang等[15]研究指出，丙种球蛋白缺乏通过促进小鼠神经炎症(TNF-α/IL-1β/IL-6/IL-10)和细胞凋亡(Bax/Bcl-2)加重脊髓损伤。反映自噬活性的标志性蛋白有MAP1LC3、Atgl2与Atg5复合体等，其中AP1LC3-Ⅰ和AP1LC3-Ⅱ参与自噬体的形成，AP1LC3-Ⅰ与磷脂酰乙醇胺结合形成AP1LC3-Ⅱ，定位于自噬体膜上，其含量与自噬体数目成正比[16]。Wang等[17]研究还发现，大鼠脊髓损伤48 h自噬体膜上标志性的MAP1LC3-Ⅱ表达量明显升高。本研究结果证实，模型组6、12和24 h脊髓组织MAP1LC3-Ⅱ阳性表达率、Caspase-3和Bax/Bcl-2蛋白表达水平高于假手术组，而干预组则低于模型组(P<0.05)。提示细胞自噬和凋亡参与了ASCI的发生过程，靶向干预JAK2/STAT3信号通路可抑制细胞自噬和凋亡水平。

3.3 JAK2/STAT3信号通路干预机制 JAK2/STAT3信号通路已被证实在炎症反应、免疫调控、肿瘤发生中发挥十分重要的作用。陈霄雷等[18]研究指出，大鼠ASCI后应用AG490干预可阻断JAK2/STAT3信号转导通路,从而抑制细胞凋亡,促进大鼠双下肢运动能力的恢复。在生理状态下，JAK2/STAT3处于非磷酸化，机体受应激刺激时可发生瞬时、快速的磷酸化转化，持续时间较短，约6～12 h，然后快速消失。而通过胞内段的酪氨酸蛋白激酶结合位点，与相应受体如IL-6、TNF-α、HSP-27等相结合，JAK2/STAT3可激活下游各种靶蛋白的酪氨酸残基，进而发挥相应的生物学效应[19]。JAK2/STAT3信号通路在ASCI发生和发展过程中发挥重要作用，可影响炎症反应、细胞自噬和凋亡的进程，进而影响神经功能的损伤和恢复情况。在神经损伤领域，STAT3也是一种具有关键作用的双功能蛋白，靶向阻断JAK2/STAT3信号通路激活可明显减轻大鼠中枢和外周神经组织创伤性或缺血损害，抑制神经细胞凋亡，改善神经功能缺损。Xia等[20]研究指出，模型组p-JAK2、p-STAT3、IL-6、TNF-α和LC3-Ⅱ的表达水平以及Caspase-3和Bax/Bcl-2的mRNA表达水平均显著高于AG-490干预组，假手术组最低(P<0.05)。认为JAK2/STAT3信号通路可介导大鼠ASCI发病后早期的自噬和凋亡活动。吴楠等[21]研究指出，脊髓损伤后miR-136-5p沉默可抑制STAT3的表达，进而抑制炎症因子的过度表达，最终抑制脊髓炎症反应。本研究中模型组6、12和24 h脊髓组织p-JAK2和p-STAT3蛋白表达水平高于假手术组，而干预组则低于模型组(P<0.05)。提示JAK2/STAT3通过激活后参与了ASCI的发生过程，而靶向干预JAK2/STAT3信号通路的激活程度能够影响ASCI进程。而各组间脊髓组织中JAK2和STAT3总蛋白表达水平变化不明显，提示只有处于激活状态的JAK2/STAT3才能发挥相应的生物学功能，影响ASCI过程。

综上所述，ASCI早期病理改变可能涉及神经细胞的炎症反应、自噬、凋亡以及JAK2/STAT3信号通路的活化，靶向干预JAK2/STAT3信号通路的活化可抑制ASCI进程，进而为ASCI的靶向治疗提供实验依据。