有氧运动和抗阻运动对肥胖大鼠脂肪组织内质网应激及炎症反应的影响

杨星雅 李鹏飞 李良 于涛 张卫英

国家体育总局体育科学研究所（北京100061）

肥胖和代谢综合症是一种慢性炎症状态，脂肪组织的炎症是诱发各种肥胖相关疾病的重要因素。内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）可能是连接肥胖、慢性炎症、外周胰岛素抵抗的一个核心机制[1.2]。ERS 是指内质网在某种应激因素，例如缺氧等的刺激下，其稳态被破坏，导致蛋白质错误折叠或者过度合成，并在内质网中积聚的一种状态[3]。未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）就是其中最重要的一种。一般来说，UPR的发生即标志着ERS的发生。

内质网膜上有三种重要的应激感受蛋白受体，分别是类PKR 的内质网激酶（PKR-like endoplasmic re⁃ticulum kinase，PERK），转录激活因子6 （activating transcription factor-6，ATF6）和肌醇需求激酶-1（inosi⁃tol requiring enzyme-1，IRE1）。这三种蛋白在正常状态下与糖调节蛋白78/免疫球蛋白结合蛋白（glucose regulated proteins78/immunoglobul in binding protein，GRP78/Bip）结合[4]，当ERS 发生后，未折叠蛋白增加，GRP78 会与其结合，使得3 种应激蛋白脱落，PERK 和IRE1 通过自身磷酸化，终止蛋白合成过程[5-6]；ATF6 脱落后转位到高尔基体而被激活，进而减少蛋白堆积[7]，恢复内质网的稳态[8]。但是，当内质网应激过于剧烈或持久时，就会启动细胞自噬和凋亡程序以及促炎转录程序[9]。一方面，ERS可以导致促炎症因子如白介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNFα）等的表达增加；另一方面，促炎症因子可以进一步诱导ERS，从而产生恶性循环[10]。

超重与肥胖人群的皮下脂肪组织中，内质网应激标识基因表达明显增加[11，12]，但长期适度的有氧运动可改善细胞过度的内质网应激[13]。有研究发现，抗阻运动也可以引起骨骼肌的内质网应激反应[14]，但目前对脂肪组织的研究中，抗阻运动的研究很少。因此，本研究通过对高脂膳食诱导的肥胖大鼠进行有氧运动和抗阻运动，了解两种运动方式对肥胖状态下大鼠的脂肪组织内质网应激状态以及其炎症反应的影响。

1 材料和方法

1.1 肥胖大鼠模型的建立

3 周龄雄性SD 大鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司）70 只，普通饲料适应性饲养1 周后，采用随机数字表将大鼠随机分为高脂组（60 只）和正常组（10只）。其中，高脂组大鼠用高脂饲料（D12451，Re⁃search Diets，New Jer．sey，USA）进行饲养，正常组大鼠用符合国家标准的啮齿类动物普通饲料进行饲养。分笼饲养，喂养10～12周，自由进食和饮水，室温18℃～24℃，湿度40%～60%，昼夜节律变化光照12 h∶12 h。12周后筛选建模成功的大鼠，筛选依据为：①高脂组大鼠体重高于正常组大鼠平均体重的20%，即为单纯性肥胖大鼠[15]。②高脂组大鼠的Lee’s指数（即评价成年大鼠肥胖程度的指标，计算方法为：

Lee’s 指数=体重（g）^（1/3）/身长（cm），其中“身长”指大鼠鼻端到肛门的距离[16]）显著高于正常组，③高脂组大鼠的血清总胆固醇和甘油三酯显著高于正常组。

经过筛选，共有33 只大鼠建模成功，成功率为55%。从建模成功的肥胖大鼠中随机选取30 只分为3组：安静对照组（C 组）、抗阻运动组（RE 组）、有氧运动组（AE组），每组10只。

1.2 训练方案

AE组大鼠用跑台法进行8周的有氧运动干预，RE组大鼠利用负重爬梯法进行8周的抗阻运动干预，C组大鼠不进行运动干预。在此期间，3组大鼠均继续利用高脂饲料喂养，大鼠维持自由进食和饮水。

1.2.1 抗阻运动方案（爬梯法）[17-19]

适应性训练：3天，不加负重爬梯8次。正式训练：以大鼠体重的50%作为初始负荷，随后每次递增负荷30 g，直到完成8 次训练，若大鼠还未完成8 次训练就已经无法爬到爬梯顶端，大鼠最后一次能够成功爬上爬梯顶端的负重认为是本次训练的最大负荷。接下来的一轮训练的前4次负重分别为前次最大负荷的50%、75%、90%和100%，如果大鼠能够完成这4 次训练，在随后的爬梯训练中，每次递增负荷30 g，直到大鼠成功爬梯8 次或无法爬到顶端，最后一次成功爬梯的负重为新的最大负荷，以此类推。抗阻训练每3 天进行1次，共进行8周，训练期间每周称量并记录大鼠体重。

1.2.2 有氧运动方案（跑台法）[18-21]

适应性训练：5 天，跑台（品牌：段氏跑台，型号：DSPT202）速度为10 m/min，训练时间10 min。正式训练：共8 周，第1 周速度为15 m/min，训练20 min；在接下来的7周时间里，训练速度每周增速1.5 m/min，运动时间每周增加5 min，到第8 周训练速度增至25 m/min，训练时间增至60 min；整个训练过程跑台坡度均为0°。每周一至周五训练，休息2 天。训练期间每周称量并记录大鼠体重。

1.2.3 样品制备

在最后一次训练结束后48 h，用10%的水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，取双侧腹股沟脂肪及双侧附睾脂肪，称重并记录后做好标记，立即放入液氮中迅速冷冻，然后置于－80℃保存。

润光养生美容酒是中医养生美容专家李润光教授在祖传养生美容宝典《回春部》的基础上,结合现代中医养生美容理论研制出来的一种可供内服、外用的酒剂。它主要由乌梅、桂圆肉、枸杞、陈皮、黑枣、茯苓、佛手、罗汉果、山楂、花椒等中药经露酒浸泡制得。前期,本课题组已对其急性毒性以及抗炎镇痛作用进行了研究,结果表明该酒的临床常用口服剂量是安全的以及该酒具有显著的抗炎镇痛作用[1]。本研究利用30天喂养试验评价该酒的亚急性毒性,为进一步开发利用该酒提供基础。

1.3 指标检测

1.3.1 血清学指标检测

抽取大鼠尾静脉，3000 rmp 离心10 min 后，用日立7020 型全自动生化分析仪进行检测甘油三酯（tri⁃glycerides，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）和低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL），试剂盒均购自Roche公司。

1.3.2 荧光定量PCR检测

取适量的组织，放入预冷的研钵中液氮研磨，用Trizol试剂提取总RNA，并将提取的RNA于－80℃保存待用。利用反转录试剂盒（Takara），将提取的总RNA在逆转录酶的作用下反转录成cDNA，然后利用从NC⁃BI 数据库中查找的目的基因的序列设计特异性引物（表1，引物均由上海生物工程有限公司合成），进行SYBR GREEN法荧光定量PCR实验（Takara）。按照说明配置20 μL反应体系，用两步法进行RT-PCR 反应，最后根据各反应孔的Ct值，用相对定量2-△△ct法算出各目的基因的相对表达量。

表1 各目的基因的引物序列

1.3.3 Western blot检测

预冷RIPA蛋白抽提试剂提取蛋白，提取时需加入蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂（Roche）。以组织重量（g）∶裂解液体积（mL）=1∶9的比例加入裂解液，电动组织匀浆器15000 rpm 转速进行匀浆，每次10 s，间隔10 s，进行3 次匀浆。匀浆时EP 管需要浸入冰水混合物中进行降温。匀浆完成后在冰上孵育20 min，4℃离心，13000 rpm，20 min。离心完成后取上清，分装保存，提取的蛋白经过BCA 法进行定量，并以RIPA 调整蛋白浓度，使加入5×还原样品缓冲液后样品终浓度为2 mg/ml，煮沸10 min 后进行SDS-PAGE 电泳。电泳使用5%浓缩胶，根据蛋白分子量大小使用8%～12%分离胶，先以90 V电压电泳，待样品进入分离胶后120 V电泳至低端，约1 h。电泳后用湿转法将蛋白转至PVDF 膜上，恒流300 mA 转膜90 mim；5%脱脂牛奶-TBST（或2%BSA-TBST）封闭60 min，将膜与稀释好的一抗4℃孵育过夜（所有一抗均为1∶1000稀释，其中磷酸化IRE1 抗体的磷酸化位点为phospho S724，均购自abcam公司），次日TBST洗膜3次，每次10 min，洗去未结合的一抗，加二抗室温孵育1 h（二抗为山羊抗兔IgG，1∶3000 稀释，购自Abcam 公司），然后TBST 洗膜3次，每次10 min，洗去未结合的二抗，最后ECL 加到膜上后反应2 min，化学发光凝胶成像仪曝光拍照，使用ImageJ软件获取条带的灰度值。将每个样本的目的蛋白条带与内参（β-actin，1∶2000 稀释，购自Abcam 公司）相比，得出目的条带的相对表达量。

1.4 统计学方法

所有数据用SPSS统计软件进行统计分析，结果以均数± 标准差表示。采用ANOVA 检验，LSD 法进行两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肥胖大鼠模型建立

高脂饲料喂养12 周后，经过体重的初步筛选，筛选出来的大鼠体重均值高于正常饲料喂养大鼠体重均值的22%，且Lee’s 指数显著高于正常大鼠（P<0.01）。从血脂结果看，筛选出来的高脂喂养的大鼠总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白（LDL）均显著高于正常大鼠，仅有高密度脂蛋白（HDL）未发现显著性差异。综上指标，本实验肥胖模型构建成功。

表2 肥胖大鼠与正常大鼠的指标比较

2.2 运动干预前后大鼠体重变化

2.3 不同运动干预方式对大鼠脂肪重量的影响

RE组和AE组的附睾和腹股沟脂肪重量均显著低于C组（P<0.05）；RE和AE组的附睾和腹股沟脂肪重量均无显著性差异（附睾脂肪：C vs. RE vs. AE：19.42± 2.47 g vs. 16.01 ± 2.41 g vs.15.08 ± 2.91 g；腹股沟脂肪：C vs. RE vs. AE：1.56 ± 0.27 g vs. 1.12 ±0.28 g vs.0.97 ± 0.20 g）（图2）。

2.4 两种运动方式对内质网应激相关基因的影响

2.4.1 对GRP78、PERK、ATF6 和IRE1 的mRNA 的影响

8 周运动干预后，AE 组GRP78 的mRNA 水平在腹股沟脂肪和附睾脂肪中的相对表达量均显著低于C组和RE 组（P<0.01，P<0.05），RE 组与C 组无显著性差异（腹股沟脂肪：C vs. RE vs. AE：1.00 ± 0.20 vs. 1.08± 0.32 vs. 0.58 ± 0.18；附睾脂肪：C vs. RE vs. AE：1.00 ± 0.16 vs. 1.18 ± 0. 18 vs. 0.73 ± 0.13）。

图1 8周运动干预对大鼠体重的影响

图2 8周运动干预后各组附睾脂肪及腹股沟脂肪重量比较

RE 组PERK mRNA 在附睾脂肪中的相对表达量显著高于C组（RE vs. C：1.34 ± 0.27 vs.1.00 ± 0.26，P<0.05），AE 组大鼠附睾脂肪和腹股沟脂肪中的PERK mRNA相对表达量与RE组和C组相比均无显著性差异。

3 组大鼠附睾脂肪和腹股沟脂肪中ATF6 mRNA相对表达量均无显著性差异。

AE组大鼠腹股沟和附睾脂肪中的IRE1 mRNA相对表达量显著低于C 组和RE 组（P<0.01，P<0.05），RE组的IRE1 mRNA 在腹股沟脂肪中的相对表达量显著高于C组（P<0.01），而在附睾脂肪中的相对表达量与C组无显著性差异（腹股沟脂肪：C vs. RE vs. AE：1.00± 0.21 vs. 1.57 ± 0.31 vs. 0.44 ± 0.19；附睾脂肪：C vs. RE vs. AE：1.00 ± 0.32 vs. 1.15 ± 0. 18 vs.0.76 ± 0.11）（图3）。

2.4.2 对GRP78和IRE1蛋白表达的影响

8周运动干预后，GRP78蛋白在AE组两种脂肪中的相对表达量均显著低于C 组和RE 组（P<0.01，P<0.05）（腹股沟脂肪：C vs. RE vs. AE：0.83 ± 0.15 vs.0.76 ± 0.17 vs. 0.36 ± 0.13；附睾脂肪：C vs. RE vs.AE：0.77 ± 0.20 vs. 0.68 ± 0.22 vs. 0.54 ± 0.12）；RE 组的GRP78 蛋白在两种脂肪中的相对表达量C 组相比均无显著性差异。IRE1蛋白磷酸化水平在AE 组腹股沟脂肪及附睾脂肪中显著低于C 组和RE 组（P<0.01）；RE组在腹股沟脂肪中的蛋白磷酸化水平显著高于C组（P<0.05），在附睾脂肪中的磷酸化水平与C组无显著性差异（腹股沟脂肪：C vs. RE vs. AE：1.15 ±0.25 vs. 1.45 ± 0.47 vs. 0.58 ± 0.12；附睾脂肪：C vs. RE vs. AE：0.87 ± 0.26 vs. 1.07 ± 0.23 vs. 0.65± 0.16）（图4）。

2.5 两种运动对炎症相关指标的影响

2.5.1 对IL-6和TNFα mRNA的影响

图3 3组大鼠脂肪组织中的GRP78（A）、PERK（B）、ATF6（C）、IRE1（D）mRNA相对表达量

图4 3组大鼠脂肪组织中GRP78（A）、IRE1（B）的蛋白表达量

8 周运动干预后，AE 组大鼠腹股沟脂肪和附睾脂肪中的IL-6 mRNA 相对表达量均显著低于C 组和RE组（P<0.01），RE 组显著高于C 组（P<0.01）（腹股沟脂肪：C vs. RE vs. AE：1.00 ± 0.24 vs. 3.32 ± 0.51 vs. 0.65 ± 0.26；附睾脂肪：C vs. RE vs. AE：1.00 ±0.22 vs. 1.85 ± 0.65 vs. 0.51 ± 0.12）。TNFα mRNA相对表达量在AE 组大鼠的两种脂肪组织中均显著低于C 组和RE 组（P<0.05），RE 组大鼠腹股沟脂肪中的TNFα mRNA相对表达量显著高于C组（P<0.05）（腹股沟脂肪：C vs. RE vs. AE：1.00 ± 0.21 vs. 1.23 ±0.18 vs. 0.83 ± 0.23；附睾脂肪：C vs. RE vs. AE：1.00 ± 0.23 vs. 0.97 ± 0.20 vs. 0.79 ± 0.12）（图5）。

图5 3组大鼠脂肪组织中IL-6（A）及TNFα（B）的mRNA相对表达量

2.5.2 对IL-6和TNFα蛋白表达的影响

8 周运动干预后，AE 组的IL-6 蛋白在腹股沟脂肪和附睾脂肪中的相对表达量均显著低于C 组和RE 组（P<0.01），RE 组的蛋白相对表达量显著高于C 组（P<0.01）（腹股沟脂肪：C vs. RE vs. AE：0.28 ± 0.05 vs.0.45 ± 0.12 vs. 0.15 ± 0.04；附睾脂肪：C vs. RE vs.AE：0.29 ± 0.06 vs. 0.62 ± 0.10 vs. 0.18 ± 0.07）。TNFα蛋白在AE组大鼠的腹股沟脂肪中相对表达量显著低于C组（P<0.05），与RE组无显著性差异。在附睾脂肪中该蛋白的相对表达量3组间均无显著性差异（腹股沟脂肪：C vs. RE vs. AE：0.53 ± 0.13 vs. 0.48 ± 0.09 vs.0.31 ± 0.07；附睾脂肪：C vs. RE vs. AE：0.33 ± 0.09 vs. 0.34 ± 0.12 vs. 0.33 ± 0.09）（图6）。

图6 运动干预后大鼠脂肪组织中IL-6（A）及TNFα（B）的蛋白表达变化

3 讨论

研究已证实运动在减重减脂、改善胰岛素抵抗、调节脂代谢等方面有重要作用，并且还可通过增加能量消耗改善肥胖状态，并减轻肥胖所引起的代谢综合征[22]。本研究8周的运动干预过程中，安静对照组大鼠体重持续升高，而两运动组大鼠体重基本平稳或略有降低，干预完成后运动组体重显著低于安静对照组，且抗阻运动和有氧运动后的腹股沟脂肪和附睾脂肪都显著减少，但二者无显著性差异，这提示两种运动方式均可有效降低肥胖大鼠的体重和脂肪重量。

研究表明，长期营养过剩会导致脂肪细胞ERS，进而导致糖尿病、非酒精性脂肪肝等多种代谢性疾病，合理的运动可改善脂肪细胞ERS，从而进一步改善脂代谢异常相关疾病[23，24]。

在Da 等[25]的研究中，游泳训练降低了高脂喂养大鼠肝脏和脂肪组织促炎症因子，如c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和B 细胞激活的核因子Κ轻链增强子（nuclear factor κ-light-chain-enhanc⁃er of activated B cells，NF-κB）的表达，同时下调了磷酸化的PERK 和真核细胞蛋白质翻译起始复合体2α（eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α）的表达，从而减缓ERS。因此，运动很可能是通过降低肥胖大鼠ERS 从而下调炎症信号，进而改善大鼠肥胖症状。但运动对内质网应激的作用也受多种因素影响[26]，运动对ERS的作用与运动强度有关，适宜的运动可以减缓ERS，使内质网恢复稳态，但若运动强度过高则会进一步加强ERS，最终引发内质网相关性死亡（En⁃doplasmic reticulum- associated degradation，ERAD）[23]。因此现有的研究结果并不统一。Bozi 等[27]的研究显示，经过8周的跑台运动，大鼠心脏中的GRP78显著降低，但Deldicque 等[28]在他们的研究中又发现，6 周的跑台运动可以上调GRP78及PERK在小鼠肌肉及肝脏中的表达。还有研究发现，12 周的有氧运动和抗阻运动均没能改变大鼠心脏中GRP78的表达量[29]。本研究中，有氧运动干预后皮下和内脏脂肪中的GRP78 mRNA 和蛋白，IRE1 的mRNA 及蛋白磷酸化水平，IL-6、TNFα的mRNA及蛋白表达量都显著降低，与上述大部分的研究结果较为一致。这说明本研究中的有氧运动方案能够有效减缓肥胖大鼠脂肪组织的ERS 程度，且能够显著地改善肥胖大鼠脂肪组织的炎症反应。关于抗阻运动，Kim 等[30]的研究发现，8周的爬梯运动后，肥胖大鼠心脏的ERS相关指标明显降低；Ziegler等[31]也发现，运动可以增加老年小鼠内脏脂肪的抗炎表型。但在本研究中，8 周的抗阻运动干预结束后，虽然GRP78没有出现显著变化，但IRE1的mRNA 和蛋白磷酸化水平，以及促炎症因子IL-6 的mRNA 和蛋白水平都出现较大幅度的提高，这说明本研究中的抗阻运动不仅未能改善ERS，反而加剧了脂肪组织中ERS 程度和炎症反应，这与前人的研究结果截然相反。对比上述两个研究，在Kim的研究中，大鼠进行负重爬梯运动的负重方案为：爬梯运动的负重最开始为大鼠体重的30%～50%，然后在8 周的时间里逐渐增加至大鼠体重的100%；Ziegler的研究中，抗阻训练在10周时间内，负重由5 g 增加到10 g，相当于体重的15%～30%。但在本研究中初始负重就是体重的50%，到训练的最后阶段，负重已经大大超过了大鼠体重。上述两个研究的训练强度都明显低于本研究的抗阻运动强度，因此，可能是由于本研究中抗阻运动方案中的运动强度过高，导致ERS 程度和炎症反应增加，但由于以上3 个研究中的研究组织并不一致，所以还不能确定是否是运动强度导致的相反结果，降低抗阻训练的训练强度会对ERS 程度和炎症反应有何种影响还需要进一步验证。

4 结论

8 周有氧运动和抗阻运动均可有效减缓肥胖大鼠的体重增长，降低脂肪重量；相较于抗阻运动，有氧运动能更有效地降低脂肪组织IRE1蛋白的磷酸化水平，进而减轻其内质网应激程度和炎症反应。