两种产香微生物分离鉴定及其发酵液增香烟草研究

杜飞 喻阑清 周家喜 许绍欢 黄小贞 邹晓

摘 要：为增加烟草制品的香味，从茅台酒酒糟和茯砖茶中分别分离出一株产香酵母菌Z2和产香曲霉菌EC1，并采用形态及分子生物学特征进行鉴定，混以绿茶末等原料发酵，提取并添加发酵液至烟叶薄片后制成卷烟，送专家评吸，并用固相微萃取与气质联用技术（SPME-GC/MS）对发酵液样品进行挥发性成分检测分析。结果表明：（1）两菌株分别为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和冠突散囊菌（Eurotium cristatum）;（2）原料經发酵后能产生兼具茶香、酒香、蜜甜香及特殊香味的产物，提取并施用于烟草后可提高其感官品质;（3）SPME-GC/MS共检出56种挥发性成分，醇类16种，占41.64%;碳氢化合物类8种，占38.01%;酮类9种，占15.99%;脂类11种，占1.55%;醛类6种，占0.74%;杂环类5种，占1.43%;酚类1种，占0.07%。利用茶叶等原料以酿酒酵母结合冠突散囊菌发酵后可获得增加烟草制品香味的发酵液。

关键词：酿酒酵母;冠突曲霉;分离鉴定;微生物发酵;烟用香料

Abstract：In order to increase the aroma of tobacco products， two aroma-producing yeasts Z2 and Aspergillus EC1 were isolated from Maotai distiller′s grains and Fuzhuan brick-tea respectively， and identified by morphological and molecular biological characteristics， mixed with green tea powder and other raw materials for fermentation.After extracting and adding the fermentation broth into the tobacco leaf slices， the cigarettes were made into cigarettes， which were sent to experts for smoking， and the volatile components of the fermentation broth samples were detected and analyzed by solid phase microextraction and gas-mass spectrometry （SPME-GC/MS）.The results showed that：（1）The two strains were Saccharomyces cerevisiae and Eurotium cristatum.（2）After fermentation， the raw materials could produce products with tea， wine， sweet and special fragrance.After being extracted and applied to tobacco， the sensory quality can be improved.（3）SPME-GC/MS detected 56 kinds of volatile components， 16 kinds of alcohols， accounting for 41.64%;8 kinds of hydrocarbons， accounting for 38.01%;9 kinds of ketones， accounting for 15.99%;11 kinds of lipids， accounting for 1.55 %;6 aldehydes， accounting for 0.74%;5 heterocyclics， accounting for 1.43%;1 phenol， accounting for 0.07%.Using tea and other raw materials to ferment with S.cerevisiae combined with E.cristatum， a fermentation broth that increased the flavor of tobacco products can be obtained.

Keywords：Saccharomyces cerevisiae;Eurotium cristatum;isolation and identification;microbial fermentation;tobacco flavor

焦油作为烟草制品燃烧时释放的主要危害物之一，“降焦减害”目前仍然是整个烟草行业亟待解决的问题[1]，在烟草中添加外源香料可改善“降焦减害”带来的烟草制品烟味降低等缺陷[2]。近年来烟草香料愈发成为卷烟香型品类构建的新一轮的发展战略选择，其中原料，标准和工艺是香型差异化的重要因素[3]。

微生物发酵是提高烟草制品吃味的重要途径之一，因为该法具有不受气候条件限制、生产周期短、对环境友好等特点[4]。直接将产香微生物接种于烟叶表面进行发酵是行之有效也是当下最受欢迎的方法，众研究表明，芽孢杆菌（Bacillus sp.）、微球菌（Micrococcaceae）及放线菌（Actinomycetes）等细菌类群中的部分菌种单一或混合接种于烟叶表面进行发酵，可迅速产生令人愉悦的香气，明显改善烟叶制品吃味[5-8]。近年来，研究发现部分真菌也能明显改善烟叶香味、提高烟叶香气量及香气质[9-10]。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和冠突散囊菌（Eurotium cristatum）是两种典型的产香真菌，前者在酿酒和乙醇生产中被广泛利用[11-12]，后者是茯砖茶、普洱茶等发酵增香的必备菌群[13]，并且二者在烟草应用中都有过相关报道[14-15]。

茶叶含有大量茶多酚、有机酸、氨基酸、维生素、咖啡碱及矿质元素等，能与烟草中的尼古丁等有害物质有效结合形成沉淀，抑制亚硝胺含量的积累，降低烟叶有害物质对人类身体健康的损害，达到降毒增香的功效[16-17]。目前，茶叶通常可作为添加剂制成烟用茶叶薄片，或直接作为香料原材料或经微生物发酵而制备烟叶香料进行使用，发现其能丰富香烟的营养成分且气味芳香[18-20]，可见茶叶可作为烟叶增香香料的理想材料。基于此，笔者设计从酒糟和茯砖茶中筛选能产香的微生物进而与茶叶发酵，以期生产出一种适用于烟叶增香的微生物发酵产物。

1 材料与方法

1.1 材料、培养基和仪器

采集自贵州茅台酒厂的酒糟样品;采集自贵州湄江印象茶叶有限责任公司的茯砖茶;购于花溪市场的绿茶;由贵州中烟工业有限责任公司提供的烟叶薄片。

1.2 试验方法

1.2.1 酒糟微生物分离鉴定

分离、筛选：用无菌水将酒糟样品稀释1000倍后，吸取200 μL稀释液涂布于YPD培养基，28 ℃培养。待单菌落长出后，以YPD固体培养基分离乳白色光滑菌株，30 ℃培养1 d，再以约50 ℃的TTC上层培养基覆盖菌落，30 ℃避光培养2 h，期间观察菌落颜色变化。菌落染色越深，则“产酒”能力越强[21]，YPD斜面培养基冷藏形态完整且染色较深的单菌落，编号备用。

形态学鉴定：将目标菌株接种于YPD培养皿，30 ℃培养3 d后对菌落特征进行观察描述，另挑取少量菌体涂布于载玻片，光学显微镜观察菌株微观形态。

分子生物学鉴定：将所得菌株参照文献[22]的方法获取菌体，随后按真菌DNA提取试剂盒进行26S rDNA提取并扩增，引物为NL1（5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′）和NL4（5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′），扩增产物送昆明擎科生物公司测序。测序结果与BLAST序列比对，后用MEGA-X作相似性分析，并用Neighbor-Joining法构建系统发育树。

1.2.2 茯砖茶微生物分离鉴定

分离纯化：从茯砖茶“金花”处挑取少量菌丝接种于PDA固体培养基上，28 ℃培养，待黄色菌落长出后再进行数次划线分离，MYA培养基斜面冷藏纯净单一的菌株，编号备用。

形态学鉴定：将目标菌株接种于MYA培养基，28 ℃培养5 d后，对菌落特征进行观察描述，另挑取少量菌体涂布于载玻片，用棉蓝染色液染色30 min，光学显微镜观察菌株微观形态，参照邹晓等[23]方法进行菌落和微观形态观察。

分子生物学鉴定：取分离菌株，接种于PDA平板上，28 ℃培养至长出黄色的菌落，刮取菌丝体，按真菌DNA提取试剂盒提取DNA和ITS片段扩增，引物为ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），扩增产物送昆明擎科生物公司测序。序列处理及鉴定方法同1.2.1分子生物学鉴定方法。

1.2.3 共同发酵

选取已鉴定菌株，将菌株Z2接种于YPD液体培养基，28℃摇瓶3 d后静置24 h，倾去上清液，用血球计数板计数，无菌水调整浓度为约106个/mL的细胞悬液，即为种子液1。将菌株EC1接种于CZG固体培养基，28℃培养5 d后，以0.01%的无菌吐温80水洗脱孢子，用血球计数板计数，调整浓度为约106个/mL的孢子悬浮液，即为种子液2。按表1（优化后）配方将微生物种子液接种1 mL于发酵瓶中，混匀后28 ℃静置发酵5 d。

1.2.4 香料提取

经试验优化，取上述发酵体系每瓶加入15 mL无菌水，搅拌均匀后用四层纱布挤压滤去固体物质，滤液6 000 r/min下离心5 min除去菌体及其他杂质后取上清液，即可得到发酵香料液。参照Rutan等[24]表征香判定方法对发酵液香味进行初步评判。参照宋培浪等[25]的方法，取样品5 g采用SPME-GC/MS法对发酵液挥发性成分进行检测分析，以未接种种子液的提取液为对照。

1.2.5 感官评析

基于优化结果，取9 mL发酵液喷施于10 g烟叶薄片上，在35℃下进行干燥30 min，在温度为25℃、相对湿度60%下进行水分平衡48 h后制成卷烟，编号S1;以无处理的造纸法制成的卷烟作为对照，编号S0，送贵州中烟工业有限责任公司7名专家评吸。

2 结果与分析

2.1 两种微生物鉴定结果

2.1.1 酒糟微生物

从茅台酒酒糟中分离得到一株具有较强产酒精能力的酵母菌菌株Z2，其菌落和微观特征如图1所示。将菌株接种在YPD培养基30℃培养2 d后，形成质地均匀，表面和边缘均光滑的乳白色隆起的菌落，背面透过培养基为浅黄色的圆形（图1-A、B）;油镜镜检发现菌株Z2细胞为单细胞、椭圆形至圆形，5-15 μm，无性生殖方式为出芽生殖（图1-C）。

分子生物学鉴定结果显示，菌株Z2与NCBI数据库中的酿酒酵母（S.cerevisiae）具有99%的同源性，以Wickerhamomyces anomalus（MT705623）作为外群，菌株Z2（MF993116）与其相关近缘属种序列构建的系统发育树如图2-A所示，菌株Z2序列与S.cerevisiae形成一个亚分支，并且与S.cerevisiae（FM201319）单独聚为一支，支持率达到100%。结合形态学特征，可确定从酒糟中分离得到的菌株Z2为酿酒酵母（S.cerevisiae）。

2.1.2 茯磚茶微生物

从湄潭茯砖茶中分离得到一株具有产香功能的真菌菌株，编号为EC1，其菌落和微观特征如图1所示。将菌株接种在MYA培养基28℃培养5 d后，形成黄色菌斑，边缘为白色的菌丝向四周辐射，靠近边缘为浅黄色，菌落中心颜色较深，背面中心为棕色，颜色从中心向边缘逐渐变淡（图1-D、E）;镜检（10×20）可发现大量闭囊壳和菌丝体，闭囊壳近球形或球形，连接众多菌丝，菌丝卷曲后进一步分化（图1-F）;在高倍镜（10×40）下可见闭囊壳破裂后释放大量金黄色孢子（图1-G）。

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