三个清香型产地不同仓贮时间烟叶中性致香物质差异分析

李显波 杨洋 彭剑涛 吴有祥 欧明毅 刘素参

摘 要：为探讨贮存时间和产地对烟叶中性致香物质含量的影响，选取2012年、2013年和2014年入库的云南楚雄、贵州黔西南及福建三明复烤片烟，采用顶空固相微萃取（HS-SPME）结合气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术测定其主要中性致香物质含量，采用方差分析、热力图、主成分分析及判别因子分析等手段分析香气物质特征，研究不同贮存时间和产地烟叶中性致香物质的含量差异和特征差异。研究结果表明，类胡罗卜素降解产物、挥发性醇类、挥发性酮类、新植二烯、西柏烷衍生物、其它类和中性致香物质总含量随着贮存时间的延长均呈现先升高而后显著降低的变化趋势，不同产地间各中性致香物质含量也存在着较大差异，以直链脂肪酸酯、烃类和挥发性醇类的含量差异最为明显。通过对中性致香物质的特征分析发现，可将中性致香物质作为判定不同产地和醇化程度的相关指标，判定方法则以判别因子分析最为适宜。

关键词：烟叶;贮存时间;产地;中性致香物质;判别因子分析

Abstract：In order to explore the effects of storage time and place of origin on the content of neutral aroma substances in tobacco leaves，flue-cured tobacco from Chuxiong of Yunnan province，Qianxinan of Guizhou province and Sanming of Fujian province，which were put into storage in 2012，2013 and 2014，were selected to determine the content of neutral aroma substances by headspace solid phase microextraction （HS-SPME） combined with gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）.The characteristics of aroma compounds were analyzed by variance analysis，thermodynamic diagram，principal component analysis and discriminant factor analysis，and the differences and characteristic changes of neutral aroma compounds in tobacco leaves in different storage time and producing areas were studied.The results showed that the total contents of carotene degradation products，volatile alcohols，volatile ketones，neophytadienes，cypressene derivatives，other types and total content of neutral aroma compounds showed a trend of first increase and then significant decrease with the extension of storage time.There were also significant differences in the contents of neutral aroma compounds among different production areas，with the most obvious differences in the content of straight-chain fatty acid esters，hydrocarbons and volatile alcohols.Through the analysis of the characteristics of neutral aroma compounds，it is found that neutral aroma substances can be used as the relevant indicators to determine different producing areas and storage time，The determination method is the most appropriate discriminant factor analysis.

Keywords：tobacco leaf; storage duration; producing area; neutral aroma substance; discriminant factor analysis

煙叶经过采收、初烤、复烤后，往往还存在青杂气较重、刺激性较大、吃味不够醇和等品质缺陷，不能直接用于卷烟生产[1-3]，为了减小烟叶品质上的不足，工业上往往将复烤后的烟叶进行醇化，以达到消除青杂气、减轻刺激性、改善余味及提高烟叶燃烧性等目的，减少烟叶品质的固有缺陷，满足工业生产的需求[3-6]。醇化是卷烟生产过程中改善烟叶品质和提高烟叶可用性必不可少的重要环节，也是改善烟叶质量必不可少的环节之一[7-9]。烟叶醇化可促进烟叶内在化学成分的转化，通过一系列的化学及生物反应将不利于烟叶品质的组分转换成有利于提升烟叶品质组分的过程[10-12]。致香物质指分子量小、具有挥发性、可以作用于人的嗅觉器官、使人产生愉悦感觉的化学成分，直接影响了烟叶的品质，很大程度上决定了烟叶品质的优与劣，是评定烟草及其制品的重要因素之一[13-14]。

国内外对烟叶醇化过程中致香物质和感官质量的变化展开了大量研究[15-19]，但大多都局限于分析烟叶醇化过程中烟叶致香物质和感官质量的变化趋势，没有对致香物质相关特征进行分析，也未系统阐明致香物质含量差异与烟叶醇化时间和产地的关系。因此，本文采用方差分析、热力图、主成分分析、判别因子分析探讨产地及贮存时间对烟叶中性致香物质含量的影响，并通过分析不同产地烟叶在醇化过程中中性致香物质特征差异，为更好地阐释中性致香物质含量在不同产地和贮存时间的变化及其特征差异提供一定的依据，为评判烟叶醇化程度提供相关指标和鉴定方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取2012年、2013年和2014年入库的云南楚雄、贵州黔西南及福建三明复烤片烟，于2017年9月取样，2018年10月测定烟叶中性致香物质含量，样品由贵州中烟工业有限公司技术中心提供并进行感官质量评价。

1.2 试验方法

1.2.1 取样方法

取样时采用五点取样法，从烟叶醇化库中选取对应醇化时间和产地的醇化烟叶，抓取共计0.5 kg的烟叶样品。

1.2.2 样品制备

将烟叶在烘箱中于45℃条件下烘干5 h后研磨（粉碎时间为20 s），过40目筛后装在自封袋中，于-20℃冰箱中保存备用。

1.2.3 测定项目与方法

中性致香物质的测定：称取3 g（准确至0.01 g）样品，放入20 mL顶空瓶中，加入20 μL浓度为3.059 mg/mL乙酸苯乙酯的二氯甲烷溶液作为内标，加盖密封。采用DVB/CAR/PDMS萃取头和CTC/Combo/PAL自动进样器进行顶空萃取，萃取温度80℃，平衡时间30 min，萃取时间1200 s。萃取结束后纤维头插入进样口，于250℃不分流进样模式下解析5 min。NIST08和WILEY275谱库检索定性，内标法定量，重复称量测定3次。

色谱条件：DB-5MS毛细管气相色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）;程序升温：初始温度60℃，以5℃/min升至130℃，然后以1℃/min升至140℃，最后以5℃/min升至240℃，保持10 min;进样口温度：270℃;传输线温度：270℃;不分流进样;载气：氦气，流速为1.0 mL/min。

质谱条件：EI源;电子轰击能量：70 eV;离子源温度：230℃;质量扫描范围33～350 u。

感官质量评价：由贵州中烟工业有限责任公司技术中心组织感官质量的评吸，将各贮存时间和产地的烟叶卷制成卷烟成品，分发于各评吸专家（7人以上），对其香气质、香气量、吃味、杂气、刺激性进行打分，计算各专家打分平均分作为感官质量评分。

1.2.4 数据处理方法

采用Excel 2007对数据进行整理与制图，SPSS 17.0进行数据的方差分析，Origin 2019实现对数据的主成分分析、判别因子分析和热力图。

2 结果与分析

2.1 贮存时间和产地对烟叶中性致香物质和感观质量的影响

2.1.1 醇化年限和产地对烟叶感官质量的影响

由表1可知，随着烟叶贮存时间的增加，三明烟叶的香气质无变化，香气量和吃味呈现先增后稳定不变，杂气先减后增，刺激性先增后穩定不变，总得分逐渐升高的趋势;黔西南烟叶的香气质、香气量、吃味、杂气呈现先增后减，刺激性先减后稳定不变，总得分逐渐升高的趋势;楚雄烟叶香气质和吃味无变化，香气量、刺激性、总得分先减后增，杂气逐渐降低的趋势。不同产地间，香气质在各产地间无明显差异，三明和黔西南烟叶的香气量和总得分高于楚雄，刺激性低于楚雄，三明烟叶杂气较高，黔西南烟叶吃味较低，楚雄烟叶刺激性较高。但在不同贮存时间和不同产地间烟叶各感官质量得分的变化并不大。

2.1.2 醇化年限和产地对烟叶中性致香物质的影响

表2为不同贮存时间和不同产地间烟叶中性致香物质含量的方差分析，从中可知，新植二烯和西柏烷衍生物茄酮的含量最高，在16.65～41.50 μg/g间，类胡罗卜素降解产物和、挥发性酮类和其他类次之，含量在0.58～1.58 μg/g间，直链脂肪酸酯和烃类最低，为0.10～0.47 μg/g间，中性致香物质的含量呈现新植二烯、西柏烷衍生物>类胡罗卜素降解产物、挥发性酮类>挥发性醇类>直链脂肪酸酯、烃类。随着贮存时间的延长，烟叶中性致香物质含量总体呈现先显著升高后显著降低的变化趋势，2013年入库的烟叶中性致香物质含量最高，2012年的最低，其中以新植二烯、挥发性酮类、西柏烷衍生物和类胡罗卜素降解产物的变化差异最为明显;不同产地烟味中性致香物质含量呈现岀部分的显著差异，其中直链脂肪酸酯含量在不同产地和不同贮存时间均达到显著差异，烃类物质含量在2012年和2014年三明烟叶显著低于黔西南和楚雄，挥发性醇类黔西南烟叶在2013年显著低于三明和楚雄，三明烟叶挥发性酮类和新植二稀含量在2014年显著高于楚雄，黔西南烟叶西柏烷衍生物含量在2012年显著高于三明。

2.2 中性致香物质的特征分析

2.2.1 中性致香物质的热力图

图1是对烟叶中性致香物质含量进行归一化处理后的热力图。在不同贮存时间烟叶中性致香物质含量随贮存时间呈现先增加后降低的变化，但其含量总体呈降低的趋势，2013年入库烟叶的含量明显高于2012年和2014年;不同产地烟叶2014年入库的三明烟叶除烃类、其它类和挥发性醇类明显低于黔西南和楚雄，其余中性致香物质含量明显高于黔西南和楚雄，2012年和2013年三明烟叶直链脂肪酸酯含量明显高于黔西南和楚雄，烃类明显低于黔西南和楚雄，三明烟叶西柏烷衍生物在2012年明显低于黔西南和楚雄，挥发性酮类高于黔西南和楚雄。表明通过热力图可以明显的看出不同贮存时间中性致香物质的含量差异，不同产地间挥发性酮类、直链脂肪酸酯、烃类含量有着明显差异。

2.2.2 中性致香物质的主成分分析

图2为基于中性致香物质含量的3个贮存时间和3个产地的烟叶样品PCA第1、2主成分得分图。通过主成分分析的横坐标（第一主成分得分）可将2013年入库烟叶与2012年和2014年入库的烟叶很好地区分开，但不能区分2012年和2014年入库的烟叶;纵坐标（第二主成分得分）可将福建三明烟叶与贵州黔西南和云南楚雄烟叶区分开，不能区分贵州黔西南和云南楚雄烟叶。表明贵州黔西南和云南楚雄烟叶中性致香物质特征较为接近，均与福建三明烟叶存在明显区别;2013年入库烟叶中性致香物质特征与2012年和2014年烟叶差异较大。

2.2.3 中性致香物质的判别因子分析

图3为基于中性致香物质含量的3个产地和3个贮存时间的判别因子分析图。通过判别因子分析可将不同贮存时间和不同产地的烟叶区分开。A为3个产地的判别因子分析，其中贵州黔西南和云南楚雄有部分重叠，但总体能够将3个产地的烟叶区分开来;B为3个贮存时间的判别因子分析，图中各不同贮存时间能较好的聚集并分散开，没有重叠的现象，说明能将不同贮存时间的烟叶很好地区分开。表明贵州黔西南和云南楚雄烟叶中性致香物质特征存在相似之处，而福建三明烟叶则与二者区别明显;不同贮存年限烟叶中性致香物质特征差异明显。

3 结论与讨论

烟叶在醇化过程中，随着醇化时间的增加，中性致香物质含量呈先升高后降低的变化趋势，这与胡有持[20]、郑峰洋[21]等通过对复烤片烟进行醇化研究发现，烟叶中多数致香物质的含量随醇化时间的增加呈先升后降趋势，其研究结果相一致;不同产地间烟叶中性致香物质含量有着部分差异，烟叶感官质量在不同醇化时间和不同产地均无明显的差异，感官质量主要是依靠评吸人员对其进行抽吸，并对主要评价指标进行评分来鉴定，但每个人对其特定评价指标的感觉均不相同，带有很大的主观性，且烟叶达到醇化已达的状态，品质稳定，人的感官灵敏度很难区分不同产地和醇化时间各指标的差异，导致感官质量没有明显差异。归一化处理的热力图能够明显地看岀不同醇化时间烟叶致香物质含量的动态变化差异，但不同产地间部分致香物质含量差异不明显，其致香物质含量相对一致，归一化时数值较为接近，导致其差异不太明显。

主成分分析能较好区分岀不同香型香韵烟叶，判别因子分析能很好判别不同产地和贮存时间的烟叶，且两个分析方法都有着明显特征差异。研究表明致香物质大多是烟叶次生代谢的产物，烟叶致香物质前体物是烟叶在生长发育中形成的[22];烤烟香型香韵的不同是由于烟叶内各种致香物质的比例不同造成[23]，不同产地的烟株生长发育条件有着或多或少的不同，导致烟叶致香物质含量有着部分差异;醇化过程中烟叶致香物质前体物发生降解和转变，使其进入次生代谢途径[24]，间接影响烟叶致香物质的含量，从而导致烟叶在不同贮存时间致香物质含量有着明显差异。主成分分析能区分岀部分贮存时间和产地的烟叶，2013年入库的烟叶致香物质含量显著高于2012年和2014年，同时贵州黔西南和云南楚雄的烟叶同属于西南高原生态区—清甜香型，福建三明的烟叶则属于武夷陵区生态区—清甜蜜甜香型[25-26]，导致其不能很好地区分开贵州黔西南和云南楚雄的烟叶。判别因子分析能很好地区分开不同醇化时间的烟叶，而产地间贵州黔西南和云南楚雄有着部分重叠，且两个产地同属于一个香型香韵，说明其致香物质特征有着相似之处，应用判別因子分析可以较为明显的将两个产地的烟叶区分。

在不同贮存时间和不同产地烟叶中，通过对中性致香物质含量进行归一化处理的热力图可视化分析，能直观地看出各中性致香物质含量间的差异。基于中性致香物质含量的主成分分析能区分2013年入库的烟叶和福建三明的烟叶，2012年和2014年入库的烟叶，其物质含量的差异较小，通过对中性致香物质含量的判别因子分析，其结果能够很好地判别出不同贮存时间和不同产地的烟叶，尤其是不同醇化时间的效果。中烟公司常将烟叶的感官质量作为评价醇化程度的标准，而致香物质又直接作用于人的感官，影响着烟叶的感官质量，因此烟叶致香物质含量作为评价醇化程度的指标具有一定的可行性，同时中性致香物质判别因子分析能够判别不同产地和贮存时间烟叶，就算产地间属于同一个香型香韵的烟叶，也能较好区分不同产地，为此可将判别因子分析作为适宜的分析方法。

烟叶感官质量在不同贮存时间和产地间均无明显变化;类胡罗卜素降解产物、挥发性醇类、挥发性酮类、新植二烯、西柏烷衍生物、其他类和中性致香物质总含量随着贮存时间的延长均呈现先显著升高后显著降低的变化趋势，不同产地间各中性致香物质含量也存在着较大差异，其中以直链脂肪酸酯、烃类和挥发性醇类的含量差异最为明显。通过对中性致香物质的特征分析发现，热力图能直观的看出不同贮存时间含量的差异，判别因子分析能明显的区分不同产地和醇化时间的烟叶，主成分分析能区分不同香型香韵和致香物质含量差异较大的烟叶;为此可将中性致香物质作为判定不同产地和醇化程度的相关指标，判定方法则以判别因子分析最为适宜。

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