MAR序列对逆转录病毒载体表达外源基因的调控作用

张 靖，张 婷，孙 强，朱 婷，石晓卫

（新乡医学院三全学院，新乡453003）

基因治疗是转基因技术中比较热门的研究内容，需要建立一个安全、高效的载体转移系统［1⁃2］。最常用的转移载体是逆转录病毒载体［3⁃4］。原因是重组病毒具有天然侵袭细胞、整合宿主细胞的能力，且基因组结构简单，感染的效率以及特异性也优于其他载体。但病毒的整合是随机的［5］，外源基因表达可能会受到基因组干扰出现沉默问题［6⁃8］。有效提高逆转录病毒载体外源基因表达是一个急需解决的问题［9］。有文献显示MAR 序列参与转录调节［10⁃11］，在克服外源基因沉默［12⁃14］、提高转基因表达效率［15］方面可以起到显著作用。但是否能提高逆转录病毒载体表达效率还需进一步的研究。

1 材料与方法

1.1 材料

Taq DNA 聚合酶、DNA Marker、dNTP 等购自宝生物工程（大连）（TaKaRa）有限公司；CAT⁃ELISA 检测试剂盒购自德国Roche Diagnostics Gmbh 公司。

1.2 方法

1.2.1 MAR序列扩增

根据GenBank 报道的人β⁃珠蛋白核基质结合区［16⁃17］（No：L22754）使用Primers 软件设计如下引物：正向引物：5'⁃TTAGTAAGACATCACCTTGCATTT⁃3'；反向引物：5'⁃AGCCATAGTTTGAGTTACCCTTT⁃3'。改良降落PCR 程序为：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性40 s，59 ℃～55 ℃退火35 s，72 ℃延伸40 s，每个退火温度4个循环，55 ℃又进行了30个循环。

1.2.2 载体构建

实验中构建3 种载体。首先，构建中间载体pLXSN⁃CAT。将pLXSN 质粒、连接CAT 片段的vector用HpaⅠ/XhoⅠ酶切后连接、转化、鉴定。其次，构建5'端含有MAR 序列的载体pLXSN5⁃CAT，连接MAR 片段的T⁃vector、pLXSN⁃CAT 质粒用EcoRⅠ/HpaⅠ酶切后连接、转化与鉴定。最后，构建3'端含有MAR 序列的载体pLXSN3⁃CAT，连接MAR 片段的T⁃vector、pLXSN⁃CAT 质粒用XhoⅠ/BamHⅠ酶切后连接、转化与鉴定。

1.2.3 细胞转染

细胞转染实验分为3 组进行，即pLXSN5⁃CAT 载体转染组、pLXSN3⁃CAT载体转染组和pLXSN⁃CAT载体转染组。在24 孔板中以每孔1×105个细胞接种包装细胞PA317，当孔中细胞到70%～80%融合时的阳离子聚合物法转染3种载体［18］。

1.2.4 阳性克隆筛选

细胞转染48 h 后传代，用含200 mg/L G418 的DMEM 培养基筛选阳性细胞。以未转染的细胞作为对照。根据细胞生长情况每天增加50～100 mg/L G418，当G418 总量加至400～500 mg/L 时不再增量［19］，随后维持G418 浓度，2～3 d 更换1 次含G418 的新鲜培养基［20］。10 d 后阳性克隆出现，挑选10 个克隆，进一步扩大细胞培养，待培养的细胞接近完全融合后移取上清液，即含有病毒的培养液。

1.2.5 阳性克隆鉴定

提取阳性细胞基因组DNA，正常PA317 细胞基因组为对照，采用针对报告基因CAT序列设计引物，扩增片段为439 bp。PCR 反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30 个循环；最后72 ℃充分延伸5 min。反应结束后分别取5 μL反应产物进行2%琼脂糖凝胶电泳。

1.2.6 ELISA分析

阳性细胞筛选成功8～11 d 后进行病毒液的制备［21］。将3种载体形成的病毒上清液感染Bel⁃7404肝癌细胞，未感染病毒的Bel⁃7404 细胞作为对照组。用G418 进行阳性细胞筛选。待筛选出的阳性细胞密度达80%～90%后通过计数调整每组细胞为相同浓度，收集细胞后进行CAT酶表达量分析。

2 结果与讨论

2.1 MAR扩增

提取外周血基因组DNA 为模板进行β⁃珠蛋白MAR 序列扩增，电泳结果如图1 所示，PCR 产物与设计相符，序列为770 bp。将人β⁃珠蛋白MAR 序列的PCR 产物连接到pMD18⁃T 载体上，送到上海生工公司进行测序。测序结果通过Blast 比对显示出人β⁃珠蛋白MAR与GenBank报道的MAR同源性高达99%。

图1 β⁃珠蛋白MAR PCR扩增电泳图Figure 1 Agarose electrophoresis of β⁃globin MAR PCR product

2.2 载体鉴定

图2（a）显示，载体经HpaⅠ/XhoⅠ酶切有660 bp的片段切出，经XhoⅠ单酶切显示一条线状DNA，酶切结果与载体构建相符，说明成功构建pLXSN⁃CAT。图2（b）显示，载体经EcoRⅠ/HpaⅠ酶切有1 300 bp 的片段切出，经EcoRⅠ单酶切显示一条线状DNA，酶切结果与载体构建相符，说明成功构建pLXSN5⁃CAT。图2（c）显示，载体经Bam HⅠ单酶切后显示一条线状DNA，经XhoⅠ/Bam HⅠ双酶切后能切出1 300 bp 的片段，与预期片段大小相符。结合载体构建图进行分析，表明已成功构建pLXSN3⁃CAT。

图2 载体酶切电泳图Figure 2 Agarose electrophoresis of vector by enzyme digestion

2.3 克隆筛选

载体转染PA317 细胞，用含500 mg/mL G418 的培养基进行阳性细胞克隆筛选，加入G418 第2 天，对照组出现细胞形态异常的情况，实验组不太明显。第3天，实验组出现细胞形态异常，对照组出现大量死亡的表型。第4天，实验组出现大片死亡的表型［图3（c）］，第6天，对照组细胞全部死亡［图3（d）］，实验组剩下零星细胞存活［图3（e）］。第12 天，实验组个别区域可见细胞分裂相，经过3 周培养，细胞逐渐形成抗性细胞克隆［图3（f）］。克隆形成后将PA317细胞转移。

图3 G418筛选后实验组与对照组细胞形态Figure 3 The experimental group and the control group after G418 screening

2.4 克隆鉴定

提取转染后的阳性细胞基因组DNA，以正常PA317 细胞基因组DNA 为对照组，采用针对报告基因CAT 序列设计引物，如图4 所示，阳性细胞扩增出的片段为439 bp，而对照组无片段扩出，表明转染后的阳性细胞含有正确的报告基因序列且抗性克隆的出现是抗性基因表达的结果。

图4 报告基因PCR电泳图Figure 4 Agarose electrophoresis of report gene PCR

2.5 ELISA分析

将不含MAR 的载体作为对照，将3 种表达载体形成的病毒上清液分别感染Bel⁃7404 细胞。收集细胞，进行CAT 酶表达量的分析。实验组中3 种载体平均CAT 酶含量如表1 所示，3'端含MAR 的载体转染的细胞平均CAT酶含量最高，比不含MAR 的质粒转染的细胞平均提高11倍（P=0.02，t=4.432），差异有统计学意义（P＜0.05），而5'端含MAR的载体转染的细胞CAT酶含量与不含MAR 的质粒转染的细胞CAT 酶含量水平相当（P = 0.957，t =0.111），差异没有统计学意义（P ＞0.05），见表2。

表1 实验组中平均CAT酶含量（A405）Table 1 The average concentration of cat enzyme in experimental group

表2 报告基因在实验组中含量检测统计学分析Table 2 Statistics analysis of cat enzyme concentration in experimental group ng/mL

注：pLXSN5⁃CAT载体组与对照组pLXSN⁃CAT相比较，*P=0.957，t=0.111，*P＞0.05，差异无统计学意义；pLXSN3⁃CAT 载体组与对照组pLXSN⁃CAT 相比较，**P=0.02，t=4.432，**P＜0.05，差异有统计学意义

3 结论

本研究将核基质结合区分别整合到逆转录病毒载体不同位置上，以研究MAR 对逆转录病毒载体在转基因方面的调控作用。结果表明，与未插入MAR 序列的载体相比，3'端含MAR 序列的载体可使CAT 报告基因的表达水平平均提高11倍，而5'端含MAR序列的载体则与未插入MAR 序列的载体的CAT 报告基因表达水平相当，表明将核基质结合区整合到逆转录病毒载体上的确可以明显提高目的基因的表达，但核基质结合区的调控作用有明显的位置效应。