毒蕈碱型乙酰胆碱受体M3在肝门部胆管癌中表达及临床意义 *

张宏伟， 王彩茹 ， 缪国东， 张化玉

(河北省承德市中心医院普外科， 河北 承德 067000)

肝门部胆管癌是起源于胆管上皮细胞恶性肿瘤。肝门部胆管癌恶性度极高，易发生淋巴结转移和神经浸润，且早期诊断率低。肝门部胆管癌对放、化疗不敏感，目前对肝门部胆管癌治疗的主要方法是手术切除，但切除率较低，且术后易复发。胆管癌患者预后差，主要原因是胆管癌早期发展过程中发生周围神经浸润[1]。文献报告，胆管癌细胞可侵入周围神经丛发生神经浸润，从而发生转移[2]。毒蕈碱型乙酰胆碱受体M3(Muscarinic acetylcholine receptor M3，CHRM3)属于G蛋白偶联受体超家族，是乙酰胆碱等神经递质受体。胆管周围神经递质的分泌对胆管癌神经浸润具有促进作用。范帅等[3]研究发现胆管癌神经浸润可能是通过激活CHRM3来促进癌细胞转移。本研究采用免疫组化法检测CHRM3在肝门部胆管癌组织中表达情况，并探讨CHRM3与肝门部胆管癌预后的关系，旨在明确CHRM3对评估患者预后方面的价值。

1 资料与方法

1.1一般资料:选取2013年1月至2017年4月本院收集的手术切除的69例肝门部胆管癌组织及69例胆管癌癌旁正常胆管组织为研究对象。其中男性44例，女性25例；年龄50～75岁，平均年龄(58.37±8.16)岁；病理分期：Ⅰ～Ⅱ期25例，Ⅲ～Ⅳ期44例；病理分级：低、中分化42例，高分化27例；无淋巴结转移27例，有淋巴结转移42例；有神经浸润41例，无神经浸润28例。纳入标准：①癌组织经专家鉴定均为肝门部胆管癌病理组织，病理组织符合肝门部胆管癌鉴定标准[4]；②首次患肝门部胆管癌；③患者临床资料完整，术后配合完成此试验。排除标准：①并发其它恶性肿瘤患者；②曾经接受过放化疗患者；③肝、肾功能严重异常患者；④有凝血功能障碍患者。本研究经本院伦理委员会批准通过。患者及直系亲属对本研究知情，并签订知情同意书。

1.2主要试剂及仪器:CHRM3抗体(批号：bs-4918R-2)购自上海恒斐生物科技有限公司；辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG二抗(批号：170-6516)购自深圳市安提生物科技有限公司；SPCC-200型生物显微镜购自东莞市谱标实验器材科技有限公司；RM2016型轮转式切片机购自德国徕卡公司。

1.3研究方法

1.3.1免疫组化法检测肝门部胆管癌组织及癌旁组织中CHRM3表达水平:肝门部胆管癌组织及癌旁组织先用10%甲醛固定，再用石蜡包埋，然后切片。切厚度约3～4μm的切片。使用二甲苯对切片进行脱蜡，然后在80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇分别进行洗脱2min，待切片无水乙醇干燥后，加入鼠抗人CHRM3抗体作为一抗，4℃冰箱过夜，然后用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗三次，再滴加羊抗鼠二抗，进行37℃孵育40min，用二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染，中性树胶封固。微镜下观察拍照镜片结果。用试剂盒提供的阳性的病理切片作为阳性对照，PBS代替一抗作为空白对照。

1.3.2结果判定:每个实验结果由三位专业人员独立判断评定。置于显微镜下进行观察。CHRM3表达于细胞膜及细胞质，阳性表达为浅黄色、棕黄色或褐色颗粒。根据细胞染色强度，阳性强度评分：无色记0分，浅黄色记1分，棕黄色记2分，棕褐色记3分。任意选择3～5个高倍镜视野下(×400)阳性细胞百分比进行计分，评分标准：0分(细胞数<5%)；1分(细胞数为5%～25%)；2分(细胞数为26%～50%)；3分(细胞数>51%)。根据染色指数(即染色强度与阳性细胞所占比例的评分乘积)大小将免疫组化结果进行等级划分：0分代表为阴性(-)，1～4分代表为弱阳性(+)，5～8分代表阳性(++)，9～12分代表强阳性(+++)。其中0～4记为阴性表达，≥5分记为阳性表达。

1.4随访:对所有肝门部胆管癌患者均接受常规随访，随访时间3年，术后第一年内每隔4个月让患者入院复查一次，术后第2、3年，每半年让患者入院复查一次，并每3个月对患者进行电话随访，记录肝门部胆管癌患者生存死亡情况。本次随访截止日期为2020年4月30日，死亡患者以死亡时间作为随访截止日期。

2 结 果

2.1CHRM3在肝门部胆管癌组织上的表达水平:CHRM3阳性表达于细胞膜及细胞质出现呈棕黄色或褐色颗粒。CHRM3在癌旁组织和肝门部胆管癌组织阳性率分别为7.25%和84.06%，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图1、表1。

图1 CHRM3在肝门部胆管癌旁组织和癌组织中表达(HE染色，×200，箭头表示肝门部胆管组织染色区域)

图2 CHRM3表达与肝门部胆管癌患者生存率的关系

2.2CHRM3表达水平与肝门部胆管癌临床病理特征的关系:肝门部胆管癌组织中CHRM3表达水平与年龄、性别无关(P>0.05)，与病理分期、病理分级、淋巴结转移、神经浸润有关(P<0.05)。见表2。

2.3CHRM3表达水平与肝门部胆管癌患者生存率的关系:Kaplan-Meier法显示CHRM3阴性肝门部胆管癌患者平均生存时间为(33.69±0.76)个月，显著长于CHRM3阳性肝门部胆管癌患者(23.37±1.02)个月(t=5.029，P=0.025)。见图2。

表1 CHRM3在肝门部胆管癌组织及癌旁组织中表达水平n(%)

表2 CHRM3表达水平与肝门部胆管癌临床病理特征的关系n(%)

表3 影响肝门部胆管癌患者预后的危险因素分析

2.4影响肝门部胆管癌患者预后的危险因素分析:单因素分析表明，病理分期、病理分级、淋巴结转移、神经浸润、CHRM3阳性均是影响肝门部胆管癌患者不良预后的危险因素。多因素分析表明，神经浸润、CHRM3阳性是影响肝门部胆管癌患者不良预后的独立危险因素(HR=2.020，95% CI为1.574～2.593；HR=2.303，95% CI为1.259～3.468，P均<0.05)。见表3。

3 讨 论

胆管癌包括肝内胆管癌和肝外胆管癌。肝门部胆管癌发生于神经纤维外部，神经浸润是其癌细胞转移的独立的形式[5]。胆管癌细胞神经浸润方式主要为神经周围间隙内生长，其次为神经纤维内弥漫性生长。研究发现，肿瘤主病灶区无神经纤维分布，但在肿瘤由肝门部胆管壁向周围组织浸润生长后，易发生肿瘤神经浸润。

肿瘤侵袭和转移与神经递质及其受体密切相关[6]。有文献报道，肿瘤细胞可沿神经突触向神经节迁移生长，肿瘤细胞的迁移具有方向性[7]。CHRM简称M受体，是一种单链跨膜糖蛋白，由460～590个氨基酸组成，在周围神经系统的腺体分泌、平滑肌收缩等中具有重要作用[8]。CHRM3是M受体中的一种，是参与分泌液体的外分泌腺细胞的G蛋白偶联受体，由七个跨膜结构域组成，在外分泌腺、神经和血管平滑肌等不同的器官系统中均有表达[9,10]。CHRM3在多种肿瘤细胞中具有表达，且可与多种信号通路相连，发挥促进肿瘤细胞增殖、转移的作用。活化后的CHRM3能激活下游的mRNA，进而调控不同信号通路，促使细胞发挥不同的功能。Vasamsetti等[11]研究显示，结肠癌组织中检测到CHRM3过度表达，其表达较正常结肠组织增加了2～128倍，CHRM3的活化促进了结肠癌胞的增殖、侵袭和迁移。大多数来源于上皮细胞和内皮细胞的癌细胞可合成和释放乙酰胆碱，扮演着自分泌和旁分泌生长因子角色，可刺激细胞生长。Felton等研究显示[12]在结肠癌中，CHRM3活化可促进结肠癌细胞的侵袭和迁移。肝脏由交感神经和副交感神经系统共同支配，这些神经来源于围绕门静脉、肝动脉和胆管的内脏神经和迷走神经。在肝癌中发现，肝脏受迷走神经支配，迷走神经可释放神经递质乙酰胆碱，乙酰胆碱能够与肝癌细胞上CHRM3结合，使CHRM3活化，活化的CHRM3可激活其下游磷酯酰肌醇-3-激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信号通路，从而诱导肝癌细胞发生转移[13]。关于CHRM3，在前期研究中发现[14]胆管周围分泌的神经递质会诱发胆管癌神经浸润，而胆管周围分泌的神经递质发挥作用主要依靠CHRM3。本研究发现CHRM3在癌旁组织阳性率显著低于肝门部胆管癌组织阳性率，提示CHRM3可能与肝门部胆管癌发生有关。病理分析发现肝门部胆管癌组织中CHRM3表达水平与年龄、性别无关，与病理分期、病理分级、淋巴结转移、神经浸润有关，提示CHRM3可能影响肝门部胆管癌病情发展，猜测CHRM3可能通过促进肝门部胆管癌细胞神经浸润发生从而促进病情发展。Kaplan-Meier法显示CHRM3阴性肝门部胆管癌患者平均生存时间显著长于CHRM3阳性肝门部胆管癌患者，多因素分析表明，神经浸润、CHRM3阳性是影响肝门部胆管癌患者不良预后的独立危险因素，提示CHRM3阳性患者可能易发生肿瘤复发，对该部分患者在治疗和术后恢复中应及时发现、治疗，避免不良预后。综上所述，CHRM3在肝门部胆管癌组织中阳性表达率显著上升，与病理分期、病理分级、淋巴结转移、神经浸润有关，有望成为肝门部胆管癌预后的监测指标。但本研究中CHRM3参与肝门部胆管癌发生发展的机制有待进一步探究。