不同种衣剂对华北大黑鳃金龟幼虫的防治效果及解毒酶活性的影响

任美凤 董晋明 李大琪 畅建武 郝晓娟 陆俊姣

关键词华北大黑鳃金龟;种衣剂;防治效果;解毒酶;红芸豆

红芸豆，学名菜豆Phaseolus vulgaris L.，经济价值较高，是山西小杂粮出口创汇的主要品种之一，每年出口量约3万t，占中国红芸豆出口总量的40%以上。农业生产中，根腐病严重危害红芸豆种植。由于蛴螬为害损坏种子，咬食根系，加剧病原菌入侵，加重根腐病的发生，导致经济效益受损，降低农民种植的积极性。加之全球气候变暖及耕作模式的变化，导致地下害虫虫口基数加大，为害时期加长。如何科学、高效防控蛴螬是当前红芸豆生产中急需解决的关键问题。

华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita是土栖性金龟子的优势种之一，是华北旱作区重要的地下害虫_，其幼虫（蛴螬）取食发芽种子和根系，食性广，为害重，为害时间长，防治非常困难。目前，生产中对蛴螬的防治主要采用农药沟施、撒毒土、灌根、毒饵诱杀等方法，费时费工，劳动成本较高。防治药剂主要是有机磷类、氨基甲酸酯类以及苯基吡唑类等传统药剂，如：克百威、甲拌磷、毒死蜱等，此类药剂具有剧毒或高残留，被限制使用或禁止使用，导致市场上用于防治蛴螬的药剂比较缺乏。因此，急需精准的施药方式和绿色、安全、高效的化学药剂。

种子包衣靶向性强，农药利用率高，保证有限的农药成分集中作用于种子和根部，精准化防治蛴螬，减少农药施用量，相比传统防治方法省时省力。李进荣等研究发现，噻虫嗪和吡虫啉种衣剂对大豆田蛴螬具有75%左右的防效;刘煜财等研究表明氯虫苯甲酰胺·噻虫嗪种衣剂对花生田蛴螬具有较高防效，但由于红芸豆对多种药剂敏感，目前尚无关于红芸豆田蛴螬防治药剂的相关研究。本研究选取4种悬浮种衣剂，采用室内盆栽方法，研究其对红芸豆的安全性和对华北大黑鳃金龟幼虫的防治效果，为其防治提供科学用药参考;采用酶学动力法测定对其解毒酶的影响，为华北大黑鳃金龟幼虫解毒机制的研究提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

供试昆虫：华北大黑鳃金龟成虫采自山西省汾阳市，室内饲养待其产卵，将卵放人装满灭菌土的培养皿中，保持土壤湿度15%左右，放于人工气候箱内，在温度（25±0.5）℃、光周期L//D=16h//8h的条件下饲养，待其孵化后，单头饲养，选择整齐一致的3龄幼虫待用。

供试作物：红芸豆，品种为‘品金芸3号，由山西省农业科学院品种资源研究所提供。

供试药剂及仪器设备：50%氯虫苯甲酰胺悬浮种衣剂（chlorantraniliprole）由美国杜邦公司提供;600 g/L吡虫啉悬浮种衣剂（imidacloprid）由拜耳作物科学（中国）有限公司提供;40%溴酰·噻虫嗪悬浮种衣剂（cyantraniliprole·thiamethoxam）（20%溴氰虫酰胺，20%噻虫嗪）由瑞士先正达作物保护有限公司提供;50%吡虫·硫双威悬浮种衣剂（imida-cloprid·thiodicarb）（37.5%硫双威，12.5%吡虫啉）由江苏龙灯化学有限公司提供;十二烷基硫酸钠、a-萘酚、固蓝B盐、a-乙酸萘酯、丙酮、还原性谷胱甘肽、1-2，4-二硝基苯、考马斯亮蓝G-250等购于生物工程（上海）股份有限公司。所用设备主要是synergy HT多功能酶标仪，美国佰腾仪器有限公司。

1.2方法

1.2.1供试药剂的防虫效果及种子被害情况评价

播种前，按各药剂的推荐使用剂量确定包衣量，本试验中50%氯虫苯甲酰胺FSC、600 g/L吡蟲啉FSC、40%溴酰·噻虫嗪FSC、50 9/6吡虫·硫双威FSC的包衣量分别为3、4、3、4 mL/kg。先将各个药剂按剂量调成浆状液，然后将红芸豆种子和药液倒入塑料袋中充分翻拌，待种子均匀着药后，倒出摊开置于通风处，晾干后备用。空白对照（CK）用清水拌种，方法同上。

试验共设5个处理，3次重复，每个重复10盆（11.5cm×17cm×12cm）。每盆播种大小均匀种子3粒，播深4～5cm，室温栽培，播时每盆接华北大黑鳃金龟3龄幼虫1头。播种30d后，调查各处理种子被害情况、活虫数量，并测量豆苗的株高、根长、鲜重、干重等。被害情况分级标准如下：0级，完好无损;1级，种子被咬食5 9/6以下;2级，5%≤种子被咬食<10%;3级，10%≤种子被咬食<25%;4级，25%≤种子被咬食<50%;5级，50%≤种子被咬食。根据以下公式计算种子被害指数、虫口存活率和防治效果。

种子被害指数=∑（各级被害株数×相对级值）/（调查总株数×5）×100;

虫口存活率一处理后虫口数/处理前虫口数×100%;

防治效果=（对照虫口存活率-药剂处理虫口存活率）/对照虫口存活率×100%。

1.2.2供试药剂对华北大黑鳃金龟幼虫谷胱甘肽

S-转移酶（GSTs）活性的影响

试验共设5个处理，将不同包衣处理的种子置于牙签盒内（每盒3颗种子）并放人相同体积的土壤（约占牙签盒体积2/3），单头饲养华北大黑鳃金龟幼虫，分别于48、72、96h后收集试虫，用去离子水清洗，吸水纸吸干水分，制备酶源。

取处理后试虫5头，称重，置于预冷的研钵中，按照1：2（rn/V）比例加入预冷的pH为7.0的66 mmol/L磷酸缓冲液，冰浴条件下研磨匀浆，于4℃，12 000 r/min冷冻离心20 min，用纱布过滤得上清液，再4℃，12 000 r/min冷冻离心10 min，取上清液备用，用66 mmol/L pH 7.0的磷酸缓冲液稀释50倍作为待测酶液。

参照Habig等的方法并加以改进，取100 vL酶液，加入1.3 mL 66 mmol/L的磷酸缓冲液（pH7.0），加入150μL 50 mmol/L还原性谷胱甘肽溶液，50 μL O.03 mol/L CDNB，放入24孔板中，迅速混匀后于340 nm测出5min内每隔1min的OD值变化;对照组不加入酶液，缓冲液加1.4mL，其他试剂体积不变，如前述测定OD值的变化。依照公式计算酶活力。

1.2.3供试药剂对华北大黑鳃金龟幼虫羧酸酯酶（CarE）活性的影响

试验处理如1.2.2，取处理后试虫5头，称重，置于预冷的研钵中，按照1：2（m/V）比例加入预冷的pH为7.0的0.04 mol/L磷酸缓冲液，冰浴条件下研磨匀浆，于4℃，12 000 r/min冷冻离心20 min，用纱布过滤得上清液，再4℃，12000 r/min冷冻离心10min，取上清液备用，用0.04mol/L pH 7.0的磷酸缓冲液稀释50倍作为待测酶液。

参照Van Aspern等的方法并加以改进，取0.5mL酶源，2.5 mL 3×10 a一乙酸萘酯，30。C恒温水浴30 min后，加入0.5 mL显色剂，于室温静置30 min，在波长600nm下测定OD值。以a-萘酚制作标准曲线，根据酶源蛋白含量测定结果，计算CarE活力。

1.2.4蛋白含量测定

采用考马斯亮蓝（G-250）法进行测定。

1.3数据处理

采用SPSS 21.0对数据统计分析，处理问差异采用单因素方差分析，用Duncan氏新复极差法进行差异显著性分析。

2结果与分析

2.1不同种衣剂对红芸豆出苗及生长的影响

4种种衣剂均对红芸豆安全，且显著提高了出苗率、根鲜重和根干重（表1）。与对照相比，出苗率均显著增加40百分点左右;根鲜重显著增加50.00%～135.29%，50%吡虫·硫双威FSC和600 g/L吡虫啉FSC增幅最高，为135.29%，50%氯虫苯甲酰胺FSC次之，为88.24%，40%溴酰·噻虫嗪FSC增幅较低，为50.00%;根干重显著增加66.67%～133.33%，50%吡虫·硫双威FSC增幅最大，为133.33%，600 g/L吡虫啉FSC和50%氯虫苯甲酰胺FSC次之，均为100%，40%溴酰·噻虫嗪FSC增幅较低，为66.67%。600 g/L吡虫啉FSC和50%吡虫·硫双威FSC可显著提高红芸豆的茎鲜重，其他2种种衣剂对其无显著性影响。50%吡虫·硫双威FSC和40%溴酰·噻虫嗪FSC可显著提高红芸豆的株高，其他2种种衣剂对其无显著性影响。

2.2不同种衣剂的防治效果及保种效果

如表2所示，40%溴酰·噻虫嗪FSC防治效果最好，为74.81%，50%氯虫苯甲酰胺FSC次之，为60.65%，二者差异不显著;50%吡虫·硫双威FSC和600 g/L吡虫啉FSC防治效果较低，分别为29.32%、19.23%，其中50%吡虫·硫双威FSC与50%氯虫苯甲酰胺FSC差异不显著。

2.3不同种衣剂对华北大黑鳃金龟幼虫解毒酶活性的影响

2.3.1不同种衣剂对华北大黑鳃金龟幼虫谷胱甘肽-转移酶（GSTs）活性的影响

如图1所示，经50%氯虫苯甲酰胺FSC和40%溴酰·噻虫嗪FSC处理48 h时，华北大黑鳃金龟幼虫体内谷胱甘肽S-转移酶活力显著低于对照，72、96h后酶活逐渐上升，与对照差异不显著。经4种种衣剂对红芸豆的茎干重均无显著影响。幅为70.18%～74.92%。600 g/L吡虫啉FSC种子被害指数最低，为6.96，40%溴酰·噻虫嗪FSC种子被害指数次之，为8.25，二者差异不显著;50%吡虫·硫双威FSC和50%氯蟲苯甲酰胺FSC次之，分别为11.19、11.70，但与40%溴酰·噻虫嗪FSC差异不显著。

4种种衣剂都可显著抑制华北大黑鳃金龟幼虫的生长，平均体重减轻0.07～0.21g，而空白对照体重平均增加0.14g。

4种种衣剂显著降低红芸豆种子被害指数，降600g/L吡虫啉FSC处理48 h时GSTs酶活显著低于对照，72、96 h时逐渐提升，96 h时显著高于对照。经50%吡虫·硫双威FSC处理48 h和72 h，GSTs酶活力与对照无显著差异;96 h时显著高于对照。结果说明：40%溴酰·噻虫嗪FSC、50%氯虫苯甲酰胺FSC和600 g/L吡虫啉FSC，在48 h均可显著降低谷胱甘肽S-转移酶酶活以起到毒杀作用，但随着处理时间的延长，谷胱甘肽S-转移酶活力均逐渐升高，且600g/L吡虫啉FSC对其诱导作用较显著;600g/L吡虫啉FSC和50%吡虫·硫双威FSC处理96h均可诱导华北大黑鳃金龟幼虫提高谷胱甘肽S-转移酶酶活以降解杀虫剂增加存活率。

2.3.2不同种衣剂对华北大黑鳃金龟幼虫羧酸酯酶（CarE）活性的影响

如图2所示，4种药剂处理48h后华北大黑鳃金龟幼虫羧酸酯酶活性均显著高于对照;处理72h后，各处理CarE酶活性均显著低于对照;处理96h后CarE酶活性均大于等于对照，其中50%氯虫苯甲酰胺FSC、600 g/L吡虫啉FSC显著高于对照，50%吡虫·硫双威FSC、40%溴酰·噻虫嗪FSC与对照差异不显著。结果说明：处理48、72h后，4种种衣剂对羧酸酯酶活性表现为先激活后抑制;96h时50%吡虫·硫双威FSC和40%溴酰·噻虫嗪FSC对羧酸酯酶活性作用不明显，600g/L吡虫啉FSC和50%氯虫苯甲酰胺FSC对其有激活作用。酶活的波浪形变化曲线表明，华北大黑鳃金龟幼虫动态调整羧酸酯酶酶活以抵抗4种种衣剂的不良胁迫作用。

3讨论

目前，国内外关于红芸豆的研究主要集中于营养价值开发和品种选育，种衣剂的研究甚少。高效种衣剂推广应用的前提和关键是对作物的安全性，本研究结果表明，4种种衣剂均对红芸豆安全，能显著提高其出苗率、根鲜重和根干重。段强等研究发现吡虫啉种衣剂促进玉米根长、根数等增加;尚栋亮等使用40%溴酰·噻虫嗪FSC对玉米种子包衣，发现其促进玉米生长，对幼苗生长安全无害;何发林等经研究证实2.40、3.20g/kg种子剂量的氯虫苯甲酰胺对花生出苗安全，以上研究均与本研究结果一致。

王猛等研究发现，溴氰虫酰胺对甜菜夜蛾、玉米螟和小地老虎的毒力比氯虫苯甲酰胺高，与噻虫嗪复配后增加杀虫谱，提高防虫效果，与本研究结果相似，40%溴酰·噻虫嗪FSC防效最高，为74.81%，50%氯虫苯甲酰胺FSC次之，为60.65%。何发林等经室内盆栽和大田试验证实了高剂量氯虫苯甲酰胺对玉米和花生地下害虫的防效高于吡虫啉，在本研究中也得到验证，50%氯虫苯甲酰胺FSC防治效果显著高于吡虫啉。复配种衣剂的防治效果高于单剂，与前人研究结果一致，50%吡虫·硫双威FSC防效高于600g/L吡虫啉FSC，并且能够有效减缓抗性的发展进程。因此在生产中应首选复配制剂防治华北大黑鳃金龟幼虫。本研究中，4种种衣剂对华北大黑鳃金龟幼虫的防治效果较其他研究低，可能是因为试验用虫虫龄较大，抵抗力较强，需在田间进行进一步试验。

近年来，山西省红芸豆根腐病发生较为严重，分析其原因，主要是由于连茬种植，导致病原菌数量增多，其次是由于土壤中地下害虫数量逐年累积，咬食种子及根部，增加病原菌入侵机会，进而增加根腐病发病率，因此，降低蛴螬为害率对防治根腐病具有重要意义。本研究中，4种种衣剂显著降低红芸豆种子被害指数，究其原因可能是由于吡虫啉对蛴螬有驱避作用或者氯虫苯甲酰胺和溴氰虫酰胺作用于魚尼丁受体，破坏昆虫的肌肉收缩功能，导致其出现拒食现象，进而降低对种子的危害程度。建议在蛴螬发生严重的地块选用40%溴酰·噻虫嗪FSC和50%氯虫苯甲酰胺FSC 2种种衣剂，在发生较轻的地方选择50%吡虫·硫双威FSC和600g/L吡虫啉FSC 2种种衣剂，降低蛴螬为害率，减少病原菌入侵机会。

当昆虫受到化学药剂胁迫时，会调节体内的解毒酶活性来抵御逆境胁迫毒害，而使其存活。何发林等发现，溴氰虫酰胺可提高小地老虎体内谷胱甘肽S-转移酶的活性，但对羧酸酯酶活性表现为前期诱导后期抑制，而余慧灵等报道溴氰虫酰胺对甜菜夜蛾幼虫体内解毒酶活性有不同程度的抑制作用。本研究中，4种种衣剂对两种解毒酶的影响也不相同。40%溴酰·噻虫嗪FSC、50%氯虫苯甲酰胺FSC和600g/L吡虫啉FSC，在48 h对谷胱甘肽S-转移酶活力的影响均表现为抑制作用，随着处理时间的延长，96 h时600g/L吡虫啉FSC和50%吡虫·硫双威FSC诱导其活性显著增加。处理48、72h后，4种种衣剂对羧酸酯酶活性表现为先激活后抑制;96h时50%吡虫·硫双威和40%溴酰·噻虫嗪FSC对羧酸酯酶活性作用不明显，600g/L吡虫啉FSC和50%氯虫苯甲酰胺FSC对其有激活作用。说明不同药剂可能由于作用方式、作用机理不同，而对同种昆虫相同或不同解毒酶有不同影响，昆虫调节不同解毒酶应对不同药剂胁迫。因此，在生产中用药时一定要轮换使用，减缓抗性的产生，提高防效。

综上所述，4种种衣剂可显著降低种子被害指数，增加出苗率，促进植物根系生长，并且40%溴酰·噻虫嗪FSC和50%氯虫苯甲酰胺FSC对华北大黑鳃金龟幼虫具有良好的防治效果。建议在红芸豆生产中根据虫情针对性推广应用，并与其他药剂轮换使用，以期为根腐病综合防控提供技术参考，为红芸豆高效种植提供技术支撑。