淮稻5号化学诱变突变体库的构建与基因快速定位

王迪　牛梅　王健　程保山　李刚　徐卫军　袁彩勇

摘要：淮稻5号是江苏地区粳稻主栽品种之一，该品种具有灌浆速度快、出糙率高、千粒质量高、抗倒能力强、耐低温等特点。但由于缺少适宜的研究材料，淮稻5号中优良农艺性状的调控机制一直没有得到解析。突变体是研究基因功能最直接、最有效的途径之一，本研究利用N-甲基-N-亚硝脲（MNU）化学诱变构建了包含3562个家系的淮稻5号突变体库，并从中筛选获得了512个表型稳定的突变体，包括株型、叶色、育性、抽穗期、早衰、类病斑等8种类型，利用MutMap技术完成了2个株型突变体的突变位点初步定位，该突变体库的构建及MutMap技术的应用，以期为淮稻5号优良性状的解析提供突变体资源。

关键词：淮稻5号;MNU;突变体库;MutMap

中图分类号：S511.032文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2021）04-0026-06

作者简介：王迪（1988—），男，山东昌邑人，博士，助理研究员，主要从事水稻遗传育种研究。E-mail：wangdirice@163.com。

通信作者：袁彩勇，研究员，主要从事水稻遗传育种研究。E-mail：hysdycy@163.com。

突变体和相对应的突变基因之间有直接的因果关系，对于基因功能的研究最具说服力，因此突变体是研究基因功能最直接、最有效的途径之一[1-2]。但自然发生突变的频率极低，高等生物的自发突变率为1×10-10～1×10-5，因此通过诱变方法获得大量的突变体材料，构建水稻突变体库，识别与鉴定突变性状的变异基因，进而明确其功能，是水稻功能基因组学研究的重要途径[3-5]。目前构建突变体的方法主要有插入突变、基因编辑、物理诱变和化学诱变等[6]。

插入突变是指将T-DNA[3，7-8]、转座子系统[9-10]、逆转座子[11-13]等DNA元件插入植物基因组中，破坏插入位点内基因的功能，同时DNA元件又可作为标签协助从植物基因组中分离出相应基因。基因编辑是一种新兴的比较精确的能对生物体基因组特定目标基因进行修饰的基因工程技术，主要包括转录激活样效应因子核酸酶（TALEN）和成簇规律间隔短回文重复（CRISPR/Cas9）系统等方法[14-16]。物理诱变是指通过快中子、质子、γ射线、X射线等方法处理植物种子，对植物染色体造成损伤，进而诱发变异[5，17]。化学诱变是指利用碱基类似物、烷化剂、嵌入剂等化学诱变剂处理种子或植株器官等诱发突变[18]。与其他方法相比，化学诱变具有操作简单、成本较低、受试验条件限制小、诱变效率高等特点。N-甲基-N-亚硝脲（MNU）是一种单碱基诱变剂，主要对DNA上的鸟嘌呤起烷化作用。Satoh等首次确立了利用MNU处理水稻受精卵的诱变方法，并指出MNU在水稻诱变中的效率高于甲基磺酸乙酯（EMS）[19]。

利用物理和化学诱变获得的突变体，如果通过传统图位克隆的办法定位突变基因，存在耗时长、效率低的缺点，极大地限制了理化诱变突变体库的发展和利用。但随着水稻基因组测序工作的完成以及二代测序技术的不断发展，MutMap技术的出现极大地提高了水稻突变体基因的克隆效率。MutMap技术通过对F2分离群体中突变表型个体进行混池测序，而后与野生型基因组序列进行比对，进而发现突变基因。同时MutMap技术所需要的F2分离群体较小，因此减少了杂交工作量，非常适用于水稻理化诱变突变体库的突变基因克隆[20]。

淮稻5号是江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所育成的迟熟中粳品种，该品种具有株型适宜、灌浆速度快、出糙率高、千粒质量高、抗倒能力强、耐低温等特点[21]。淮稻5号尤其适宜直播，直播中丰产性、抗逆性、稳产性和品质等综合性状均较好，自推广以来一直占据江苏省水稻品种市场重要份额，根据全国水稻数据中心统计，淮稻5号目前累计推广面积超过175.2万hm2（http：//www.ricedata.cn/variety/varis/604604.htm）。但由于缺少适宜的研究材料，淮稻5号优良农艺性状的分子调控机制一直没有得到解析。因此，构建淮稻5号的突变体库，选取适宜的突变体材料解析调控淮稻5号株型、抗倒、灌浆快、耐低温、高出糙率等优良性状的分子机制，能够为后续品种的开发提供新的基因资源和理论基础。本研究利用MNU诱变构建淮稻5号的突变体库，通过对3562个突变家系的筛选获得了512个表型稳定的突变体。此外，利用MutMap技术对其中的2个矮杆突变体进行了突变基因的定位。该突变体库以期为淮稻5号优良性状的解析提供突变体资源，具有一定的生产意义和理论意义。

1材料与方法

1.1MNU诱变

2017年正季于江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所水稻育种基地选取分蘖较多、生长旺盛的淮稻5号盛花期植株进行MNU诱变，当天下午剪除已开花的颖花，第2天下午剪除未开花的颖花同时修剪多余分蘖及叶片，第2天23：00将预备的穗子浸泡在1mmol/L的MNU溶液中1h，之后用流水冲洗15min，第3天将处理过的植株种植于田间，自交结实获得M1种子。

1.2突变体种植及筛选

收获的M1种子同年冬天送至海南陵水南繁育种基地加代，单株收种获得M2种子。2018年正季将M2种子种植于江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所水稻基地，每个M2家系种植30株。对M2家系进行全生育期筛选分离出有明显突变表型的家系，出现突变植株的家系按单株分别收取突变植株与野生型植株的种子。对未分离出突变表型的家系单株收种磨米鉴定米质与出糙率。同时所有M2家系分家系混收一部分种子储存于种子库中。所有诱变材料均按正常大田条件管理，单株插秧。

1.3遗传分析

hw5、hw7突变体与淮稻5号做正反交构建遗传分析群体，同年冬季于海南陵水加代获得F2种子，第2年正季将F2分离群体种植于淮安，成熟期统计F2群体中野生型表型和突变体表型植株数量，计算分离比，進行卡方（χ2）测验。

1.4基因定位

从hw5×淮稻5号与hw7×淮稻5号的F2分离群体中分别取野生型表型单株和突变表型单株叶片各30个，分别提取DNA后，取等量混合形成DNA混池。采用MutMap方法克隆株型基因，获得基因序列和突变位点信息，MutMap由成都天成未来科技有限公司完成。

2结果与分析

2.1突变体库的创建和筛选

30株只保留当天开花颖花的淮稻5号植株经MNU处理后结实收获M1种子，将M1种子种植于海南，共获得M1植株4887株，其中完全不育的M1植株174株，分单株收种获得M2种子。M2种子种植后共获得M2家系3562个。对M2家系进行全生育期观察，筛选株型、叶色、抽穗期、育性等方面的突变体材料，共获得512个突变家系，包括株型、叶色、育性、抽穗期、早衰、类病斑等8种类型，占总家系数量的14.37%。其中株型突变体出现频率最高，为203个，占总家系数量的5.70%;脆秆突变体出现频率最低，为2个，占总家系数量的0.06%（图1、表1）。

2.2株型突变体遗传分析

为进一步了解本研究突变体库的质量，从中选取hw5及hw72个株型突变体进行MutMap基因定位。其中hw5表型为半矮秆，hw7表型为矮秆、分蘖角增大（图1-C、图1-D、表2）。分别将hw5、hw7突变体与淮稻5号正反交，构建F2分离群体。2组试验F1均表现为野生型表型，F2中出现野生型表型和突变体表型2种分离，分别统计各个F2群体中野生型表型和突变体表型植株的数量，进行卡方测验。结果表明， hw5、hw7分离群体的分离比均符合3∶1（表3）。说明， hw5、hw7的表型均受隐性单核基因控制。

2.3MutMap定位

在hw5、hw7的F2（hw5/淮稻5号，hw7/淮稻5号）分离群体中，分别取野生型表型单株和突变表型单株叶片各30个，分别提取DNA后，取等量混合构建DNA池，利用MutMap方法克隆突变基因。根据SNP密度图选择SNP密度大的区域为候选区段（图2），利用varBScore算法，将方差进行对数处理，获得最显著的变异连锁区段，通过计算不同混池间各突变型的频率距离，采用距离差异来反映标记与目标区域的连锁强度，根据得到的混池间的SNP位点集及基因型的深度信息，计算不同混池间的突变频率差异，最终获得候选基因（表4）。

3结论与讨论

本研究通过MNU诱变构建1个包含3562个家系的淮稻5号突变体库，从该突变体库中共筛选获得512个突变家系，总诱变概率为14.37%。其中包括株型、叶色、育性、抽穗期、早衰、类病斑等多种类型，不同类型突变体出现的频率为0.06%～570%。该突变体库突变类型丰富，通过对该库中相关突变体的基因定位和功能研究有助于解析淮稻5号优良农艺性状的分子调控机制，能够为后续品种的开发提供新的基因资源和理论基础。尽管已从该突变体库中筛选获得了大量突变体，但是介于筛选手段及试验条件的限制，未能从该突变体库中筛选到灌浆快、灌浆期耐低温相关性状的突变体，这意味着该突变体库中仍然有大量未被筛选出的突变体，随着筛选手段和试验条件的改善，该突变体库还有巨大的潜力可以挖掘。

MutMap技术基于近些年日趋完善的测序技术而产生，通过将突变群体的测序结果与野生型相对比，可以快速定位突变基因。为了满足分子标记多态性的需求，传统的图位克隆一般采用籼粳杂交构建分离群体，所需分离群体数量大，且分离群体容易受到遗传背景差异的影响从而增加表型判断的难度。与传统图位克隆相比，MutMap所需群体较小，且定位群体遗传背景一致，可以避免父母本之间遗传背景差异的影响，降低基因克隆成本的同时，大大缩短了基因定位所需的時间。

本研究利用MutMap技术对hw5和hw72个株型突变体进行了基因定位。通过遗传分析证明hw5和hw7的突变表型均受隐性单核基因控制，适用于通过MutMap的方法定位突变基因。通过将hw5、hw7与淮稻5号分别杂交后构建约300～400个单株的F2分离群体，从中分别筛选野生型表型和突变型表型单株各30个，提取DNA后等量混合构建混池，经过重测序和比对分析后获得候选基因。其中hw5筛选获得5个导致氨基酸序列变化的SNP位点，而hw7筛选到1个导致氨基酸序列变化的SNP位点，后续可以通过在分离群体中验证突变位点是否与突变表型共分离获得突变基因。

本研究利用MNU诱变获得了包含3562个家系的淮稻5号的突变体库，并从中筛选获得512个突变家系。随着筛选技术手段的改进，该突变体库还有巨大的潜力可以挖掘。同时利用MutMap技术对hw5和hw72个株型突变体进行基因定位。借助MutMap技术，对该库中相关突变体的基因定位和功能研究有助于解析淮稻5号优良农艺性状的分子调控机制，能够为后续品种的开发提供新的基因资源和理论基础。

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