发酵法制备刺梨果渣膳食纤维工艺研究及氨基酸分析

张想，李立郎，杨娟*，杨小生，廖秀，沈曼筠

1.贵州大学酿酒与食品工程学院（贵阳 550025）；2.贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室（贵阳 550014）

刺梨（Rosa roxbughiiTratt）是蔷薇科蔷薇属多年落叶灌木缫丝花的果实[1]，原产于中国西南地区[2]。刺梨含有多糖、维生素、膳食纤维、有机酸及各种人体必需的氨基酸、微量元素等，且具有抗氧化、抗癌防癌，降血糖、降血脂、健胃等药用价值[3-5]。在刺梨的食品加工过程中有近50%的残渣被丢弃[6]，造成严重的资源浪费。刺梨果渣中含有丰富的粗蛋白、维生素和粗纤维等[7]，有很高的再利用价值。膳食纤维（DF）被称为“第七大营养素”[8]，因具有抗癌、抗氧化、降低胆固醇、改善胃肠健康、预防心血管疾病等作用[9-12]而备受关注。

膳食纤维的提取方法主要有化学法、酶法、物理法、发酵法等[13]。其中，微生物发酵法对可溶性膳食纤维有较好的改性效果[14]，且具有易操作、成本低、污染小、得率高等优点[15]。平菇类木腐菌能产生一些多酚氧化酶和纤维素酶来降解刺梨果渣中的木质纤维作为自身碳源，刺梨果渣含有大量有机酸物质，pH呈弱酸性，适用于平菇等木腐菌类生长[16]，其中的粗蛋白、糖类和粗纤维等物质可作为真菌生长所必备的氮源和碳源[17]。

为实现刺梨果渣高值化利用，试验以刺梨果渣为原料，以平菇为发酵菌种，采用单因素结合响应面优化法[18]，探究平菇发酵提取刺梨果渣中膳食纤维的最佳工艺参数，旨在提高刺梨果渣中膳食纤维含量；通过氨基酸自动分析仪检测最佳发酵工艺处理前后的氨基酸含量变化，为更好地开发利用高质量功能产品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

刺梨果渣（贵州恒力源天然生物科技有限公司提供，新鲜刺梨经榨汁等加工后的副产物，干燥处理后备用）；平菇一级种（贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室）；体积分数95%乙醇、CaCl2、KCl、丙酮（天津市致远化学试剂有限公司）；α-淀粉酶、蛋白酶、淀粉葡萄糖苷酶、MES-TRIS（大连美仑生物科技有限公司）。

PDA培养基[19]：200 g马铃薯切片，加热煮沸，过滤，加入20 g葡萄糖和18 g琼脂，再次加热煮沸10 min，调整体积至1 L后用玻璃棒搅拌溶化均匀后分装试管，在121 ℃、0.1 MPa条件下灭菌30 min，冷凝后待用。

1.2 仪器与设备

L-8800全自动氨基酸分析仪（日本HITICHI公司）；DK-98-II恒温振荡水浴箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；FA2004N分析天平（上海菁海仪器有限公司）；SX2-4-10TZ马弗炉（厦门仪宸科技有限公司）；101-2A烘箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；BZF-50真空干燥箱（常州诺基仪器有限公司）；FE20 pH计（梅特勒-托利多仪器有限公司）；LDZV-75KBS不锈钢压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；SW-CJ-2F双人双面净化工作台（苏州净化设备有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种的活化

在无菌条件下将保藏良好的平菇菌种母种接种到制备好的PDA斜面固体培养基上，于28 ℃恒温培养箱种恒温培养5～7 d，采用上述方法活化3次。

1.3.2 工艺流程

新鲜刺梨果渣→调料混匀、配制发酵培养基→装瓶、灭菌（121 ℃，30 min）→冷却后接入活化好的平菇菌种→发酵培养（26 ℃条件下，培养至菌丝体长满培养基即为发酵完全）→灭菌→烘干→粉碎（过孔径0.074 mm筛）→平菇发酵刺梨果渣膳食纤维测定

1.3.3 单因素试验

参照1.3.2的膳食纤维提取工艺流程，选取氯化钙添加量、氯化钾添加量、糖含添加量、液料比4个因素进行试验，以刺梨果渣膳食纤维得率为指标，研究平菇发酵在不同条件下对刺梨果渣膳食纤维得率的影响，单因素试验设计（见表1）。

表1 刺梨果渣膳食纤维单因素试验水平表

1.3.4 响应面试验设计

在单因素试验基础上，运用Design-Expert 8.06软件中的Box-Behnken试验设计方法，选择氯化钙添加量（A）、氯化钙添加量（B）、糖添加量（C）、液料比（D）为自变量，平菇发酵SDF得率为响应值进行Box-Behnken响应面试验设计，各因素的3个水平采用-1，0和1进行编码，见表2。

表2 响应面因素及编码水平

1.3.5 刺梨果渣膳食纤维提取率的测定

根据GB 5009.88—2014《食品安全国家标准 食品中膳食纤维的测定》中所示的酶重量法对原料的总膳食纤维（TDF）含量、不溶性膳食纤维（IDF）含量及可溶性膳食纤维（SDF）含量进行测定。

1.3.6 氨基酸的测定

参照GB 5009.124—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》，准确称取1.000 0 g样品，加入10 mL的6 mol/L盐酸于水解管中，在充氮气状态下封口，将已封口的水解管放在110±1 ℃的恒温干燥箱内，水解22 h后，取出冷却至室温。打开水解管，将水解液过滤后，用去离子水多次冲洗水解管，将水解液全部转移到50 mL容量瓶内，用1.0 mL pH 2.2的柠檬酸钠缓冲液溶解，振荡混匀后过0.22 μm滤膜后，转移至仪器进样瓶，为样品测定液。混合氨基酸标准工作液和样品测定液分别以相同体积注入氨基酸分析仪，以外标法通过峰面积计算样品测定液中氨基酸的浓度。

1.4 数据分析及处理

数据以x±SD表示，利用Excel 2018进行标准曲线，应用SPSS 21.0软件进行差异显著性分析，以p＜ 0.05为差异显著，Origin 9.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 氯化钙（CaCl2）添加量对平菇发酵刺梨果渣DF得率的影响

由图1可知，氯化钙添加量0.6%～1.0%时IDF得率逐渐上升，1.0%时达到最大；之后IDF得率逐渐减小；随着氯化钙添加量增加，SDF得率均呈逐渐增加趋势；氯化钙添加量达到1%时，SDF得率达到最大值；继续增加其含量，SDF得率反而都下降。不同浓度的钙离子对食用菌菌丝生长有着不同程度影响[20]，钙离子可以促进平菇菌丝生长，因菌丝体生长速度、数量增加，SDF得率逐渐增加。但随着钙离子浓度增高，菌丝体对钙的吸收率降低，菌丝生长受到抑制，导致SDF得率降低，故采用平菇发酵刺梨果渣氯化钙最佳添加量均为1.0%。

图1 CaCl2添加量对平菇发酵刺梨果渣DF得率的影响

2.1.2 氯化钾（KCl）添加量对平菇发酵刺梨果渣DF的影响

钾元素是真菌生命活动不可缺少的营养物质之一[21]，在调节代谢、维持离子稳态、调节渗透压等众多生命过程中发挥重要作用[22-23]。由图2可知，氯化钾添加量对IDF的得率影响作用不大。氯化钾添加量小于0.6%时，菌丝的生长受到抑制作用；而在氯化钾添加量0.6%时SDF得率均为最大值；培养基中钾离子浓度过高会导致菌丝细胞内外渗透压和酸碱平衡失调，所以SDF得率随着氯化钾添加量增加而降低。故采用平菇发酵刺梨果渣氯化钾最佳添加量均为0.6%。

图2 KCl添加量对平菇发酵刺梨果渣DF得率的影响

2.1.3 糖添加量对平菇发酵刺梨果渣DF的影响

菌种生长过程中受到碳源、氮源种类及浓度等因素影响[24]。由图3可知，糖添加量4%时，IDF得率均达到最高值；糖添加量超过4%时，IDF提取率随糖添加量升高而减小；糖添加量在2%～4%范围内，由于培养基中碳源增加，有利于菌种生长发育，SDF得率得以提高；糖添加量4%时SDF得率均得到最大值；继续增大糖添加量，导致培养基内碳氮比例失调，引起菌丝停止生长或生长缓慢，故SDF得率逐渐降低。因此采用平菇发酵刺梨果渣糖最佳添加量均为4.0%。

图3 糖添加量对平菇发酵刺梨果渣DF的影响

2.1.4 液料比对平菇发酵刺梨果渣DF得率的影响

在提取过程中适当的液料比能在细胞内外形成较大的浓度差，有利于DF的溶出，但是过高的液料比会阻碍DF的溶出，而过低的液料比不利于溶出[25]。由图4可知，刺梨果渣IDF得率随液料比增加而变大，液料比为7∶1（mL/g）时达到最大值，此后IDF得率呈下降趋势。液料比＜7∶1（mL/g）时，不利于菌种发酵，SDF提取不完全，得率较低；液料比为7∶1（mL/g）时，SDF得率都达到最高值；液料比继续增加，由于刺梨果渣中SDF含量有限，故溶出率不再增加。因此，采用平菇发酵刺梨果渣最佳液料比均为7∶1（mL/g）。

图4 液料比对平菇发酵刺梨果渣DF得率的影响

2.2 Box-Behnken试验设计及响应面分析结果

2.2.1 平菇发酵刺梨果渣的Box-Behnken试验设计及响应面分析结果

在单因素试验的基础上，利用Box-Behnken中心组合设计原理进行试验设计，根据表2中的编码与水平进行试验，设计方案与试验结果见表3。对试验结果进行多元拟合回归，得到回归方程：Y（平菇发酵SDF得率）=7.24+0.36A+0.25B+0.40C+0.29D-0.19AB-0.20AC-0.12AD-0.19BC-0.26BD-0.100CD-0.75A2-0.50B2-0.44C2-0.58D2。

表3 平菇发酵刺梨果渣响应面试验设计及结果

表4 平菇发酵刺梨果渣中可溶性膳食纤维得率的回归模型方差分析

由表3可知，因受到不同因素及其添加量的影响，平菇发酵刺梨果渣SDF得率有所不同。对响应面法优化试验结果建立模型，方差分析结果见表4，可知该模型p＜0.000 1，说明此模型真实可靠。失拟项的p=0.060 8，模型的失拟度差异不显著。因此，该模型的拟合程度比较好。相关系数R2=0.982 9，说明模型与实际试验拟合情况接近。

2.2.2 平菇发酵刺梨果渣响应面结果分析

根据回归方程，各因素及其交互作用下对平菇发酵刺梨果渣SDF得率影响的响应面图及等高线图如图5所示。三维响应面可以反映每两个因素之间的交互作用，等高线形状越趋于椭圆形，表明其交互作用越明显。从图5可以看出，氯化钾与液料比之间的响应面曲线较为陡峭，而且等高线接近椭圆形，两因素之间交互作用最为明显，与方差分析结果一致；因此可得，影响平菇发酵刺梨果渣SDF得率的主次因素顺序为糖添加量（C）＞氯化钙添加量（A）＞液料比（D）＞氯化钾添加量（B）。

2.2.3 平菇发酵刺梨果渣SDF得率最佳提取条件优化与验证

由响应面分析可得，平菇发酵刺梨果渣SDF提取最佳工艺参数为：氯化钾添加量0.63%、氯化钙添加量1.02%、糖添加量4.37%、液料比7.09∶1（mL/g）。在此条件下SDF得率理论值可达7.39%。考虑到试验操作的可行性，将提取工艺参数修正为：氯化钾添加量0.6%、氯化钙添加量1.0%、糖添加量4.0%、液料比7.0∶1（mL/g）。在此条件下重复3次验证试验，SDF得率为7.29%±0.05%，与理论值大致一致。证明该模型是可行真实的，具有实用价值。

图5 各因素交互作用对平菇发酵刺梨果渣SDF得率影响的响应面图

2.2.4 游离氨基酸的含量与分析

人体所需氨基酸主要包括必需氨基酸（EAA）和非必需氨基酸（NEAA），而必需氨基酸必须从体外摄取，所以必需氨基酸的含量和构成比例是评价蛋白质营养价值的重要标准，发酵前后刺梨果渣中氨基酸的含量见表5。由表5可知，发酵过程增加刺梨果渣中游离氨基酸的含量，游离氨基酸含量由0.234 6 mg/mL增加至1.083 9 mg/mL。氨基酸作为机体营养的第一要素，不仅直接或间接参与各种生命活动，还在食物、食品品质方面起到重要作用。食物蛋白营养价值的优劣主要取决于所含必须氨基酸的种类、数量和组成比例，其组成比例越接近人体需要氨基酸的比例，则其质量就越优[26]。经平菇发酵后的刺梨果渣中必需氨基酸的含量比新鲜果渣高11倍，这表明，发酵过程显著提高必需氨基酸含量，使刺梨果渣更具营养价值。

自然界中氨基酸有20余种，其中谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、赖氨酸9种氨基酸一般在植物中含量少，而且有些在人体内不能合成，但又是维持机体平衡所必需的重要物质，称为药用氨基酸[27]。谷氨酸作为神经中枢及大脑皮质的补剂，对于治疗脑振荡或神经损伤、癫痫以及对弱智儿童均有一定疗效，又能预防和治疗肝昏迷，保护肝脏，是肝脏疾病患者的辅助药物[28]。精氨酸是鸟氨酸循环中的一个组成成分，具有极其重要的生理功能，有助于将血液中的氨转变为尿素而排泄出去，故对高氨血症、肝脏机能障碍等均有功效，具有提高机体免疫力的作用[29]。天冬氨酸对增强肝功，缓解疲劳，预防心脏病、高血压等疾病起到重要作用[30]。发酵后刺梨果渣中药用氨基酸占TAA含量的68%左右。因此富含各种药用氨基酸的发酵刺梨果渣可作为药用价值较高的植物蛋白资源。

表5 发酵前后刺梨果渣中氨基酸的含量

3 结论与讨论

刺梨果渣中虽富含丰富的营养物质，但存在适口性差、消化率低等缺点，而微生物发酵法可减少果渣中纤维素、木质素、植酸、果胶、单宁等抗营养成分，同时提高其粗蛋白、氨基酸等营养物质含量，改善果渣的营养结构和营养价值，提高其利用率。试验采用食用菌发酵法提取刺梨果渣中膳食纤维，采用单因素试验和响应面分析法优化SDF得率，结合实际分析得到平菇发酵刺梨果渣提取SDF最佳工艺条件：氯化钙添加量1%、氯化钾添加量0.6%、糖添加量4%、液料比7∶1（mL/g）。在此条件下，平菇发酵SDF得率为7.33%，高于未接种菌种的新鲜刺梨果渣可溶性膳食纤维得率（用酶法提取测得SDF得率约1.83%），为发酵刺梨果渣SDF得率最高值。且经发酵工艺优化后的刺梨果渣中总游离氨基、必需氨基酸及药用氨基酸含量显著提高，增加刺梨果渣的营养价值。果渣作为一种来源丰富而又经济的资源，综合开发利用刺梨果渣，既能提高果渣利用价值，延长果渣加工产业链，又能减少对环境的污染。运用食用菌发酵制备膳食纤维不仅工艺简便，提取条件温和，所得膳食纤维质量较好，而且具有可食用性，发酵后果渣营养成分更高。这不仅丰富刺梨果渣的加工产品，提高其利用率，还对刺梨果渣的开发和综合利用提供理论参考。