不同培养和贮藏条件对‘凤丹白’牡丹花粉萌发的影响

张 庆，陈一凡，赵鹏飞，宋子怡，张钰钰，张 芹

(河北农业大学园林与旅游学院，河北 保定，071000)

‘凤丹白’是杨山牡丹(Paeoniaostii)较为常见的栽培品种，它主要的观赏价值在于花色纯白、花头直立，然而由于其花色较单调较少在园林观赏中应用，而多注重其药用价值[1]。‘凤丹白’是目前油用牡丹的主要品种，其结籽量大、出油率高、生长势强[2]，具有很好的适应性[3]，其籽油中含丰富的不饱和脂肪酸等，具有较高的营养价值[4]。花粉早期采集、贮藏、生活力的测定是进行人工辅助授粉或杂交授粉的基础[5]。本试验采用离体萌发测定法，用液体培养基培养‘凤丹白’花粉，而后在光学显微镜下观察花粉萌发状况[6]。根据蔡祖国等[7]的方法，进行适当调整后，再根据秦瑶等[1]的研究结果，将花粉离体培养8 h，对比不同质量浓度的蔗糖和硼酸组合溶液与花粉萌发的关系，进一步筛选得到最佳培养基后，进行相关的花粉萌发试验，探究最佳的贮藏条件，进一步了解‘凤丹白’牡丹花粉的生活力，为‘凤丹白’牡丹的育种工作提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2019年4月中下旬进行，材料采自河北农业大学试验苗圃内‘凤丹白’牡丹。开花期早 8:00～9:00采集花粉，在无风天气下，用镊子轻采花药，放在制版转印纸纸袋中带回实验室。将采集下来的花药放在硫酸纸上，室温下自然阴干24 h，待花药开裂、花粉自然散出后去除杂质收集，将收集好的花粉放在5 mL离心管中密封，4 ℃条件下贮藏备用。

1.2 试验方法

1.2.1不同质量浓度蔗糖下花粉萌发情况将花粉用不同质量浓度的蔗糖(30，50，80，100，150 g·L-1)溶液培养8 h，观察萌发情况，每个处理3次重复，每个重复随机取3个视野进行观察，每个视野统计花粉100粒以上，记录数据，以清水为空白对照，统计萌发率，萌发标准为花粉管的长度≥花粉粒直径的2倍，下同。

萌发率=(萌发的花粉数/花粉总数)×100%

1.2.2不同质量浓度硼酸下花粉萌发情况将花粉用不同质量浓度的硼酸(0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 g·L-1)溶液培养8 h，观察萌发情况。

1.2.3不同质量浓度的蔗糖和硼酸组合溶液对花粉萌发的影响根据律春艳等[8]和蔡祖国等[7]研究所选的培养基质量浓度作为参考，进行适当调整。采用液体培养法，用添加不同质量浓度的硼酸(0.04，0.06，0.08 g·L-1)和蔗糖(60，80，100，120 g·L-1)的液体培养基培养8 h，观察花粉萌发情况。

1.2.4不同培养时间对花粉萌发的影响筛选出最佳培养基后，在(25±1)℃恒温箱中培养花粉，每隔1 h观察1次萌发情况，连续观察12 h，以确定花粉离体培养的最佳时间。

1.2.5不同温度贮藏条件下干花粉萌发率的变化趋势将收集备用的‘凤丹白’花粉分别在30，25，4，-18，-80 ℃条件下贮藏0，1，3，5，7，9，12 d后，取出，用最佳培养基培养8 h后，观察花粉萌发情况。

1.2.6湿花粉在25，30 ℃条件下萌发率的变化趋势 将刚采下的新鲜状态下的‘凤丹白’花朵直接带回实验室，用镊子摘下花药，分别在25，30 ℃条件下贮藏0，1，2，3，5，7 h，观察花粉活力变化。

1.3 数据统计与处理

数据分析采用Excel 2010和SPSS 16.0软件进行数据处理及做图。

2 结果与分析

2.1 不同质量浓度蔗糖下花粉萌发情况

随着蔗糖质量浓度的增加，花粉萌发率呈现先升高后下降的趋势(图1)，在清水对照中花粉萌发率仅为6.04%，当蔗糖质量浓度在0～100 g·L-1时，花粉萌发率随着质量浓度的增加而不断提高，在蔗糖质量浓度为100 g·L-1时萌发率达到最大值(51.69%)，比对照提高了45.65个百分点，极显著高于对照及其他处理。

2.2 不同质量浓度硼酸下花粉萌发情况

随着硼酸质量浓度的提高，花粉萌发率先升后降(图2)。当硼酸质量浓度在0～0.06 g·L-1时，花粉萌发率随着质量浓度的增加而不断提高，当硼酸质量浓度为0.06 g·L-1时萌发率达到峰值(36.71%)，比对照提高了30.99个百分点，极显著高于对照及其他处理。质量浓度为0.04，0.08 g·L-1的处理之间差异不显著。当硼酸质量浓度在0.06～0.10 g·L-1时，花粉萌发率随着质量浓度的增加而不断下降，在质量浓度为0.10 g·L-1时花粉萌发率仅有13.67%。

图1 不同蔗糖质量浓度下花粉萌发情况 图2 不同硼酸质量浓度下花粉萌发情况

2.3 不同质量浓度的硼酸和蔗糖组合溶液对花粉萌发的影响

将花粉置于不同质量浓度组合的液体培养基进行离体萌发培养，不同质量浓度的硼酸和蔗糖对花粉萌发率有显著影响(表1)。用0.04 g·L-1硼酸+60 g·L-1蔗糖培养基培养花粉，萌发率只有40.42%。在硼酸质量浓度为0.06 g·L-1及蔗糖质量浓度为100 g·L-1时，花粉萌发率达到最高值，为63.22%，是最适的花粉离体培养质量浓度。而继续加大硼酸和蔗糖的质量浓度，促进作用减弱，花粉萌发率呈现下降趋势，当硼酸质量浓度为0.08 g·L-1及蔗糖质量浓度为120 g·L-1时，花粉萌发率降低到40.40%。当硼酸质量浓度固定不变时，加入蔗糖，花粉萌发率出现先升高后下降的趋势；当蔗糖质量浓度固定不变时，加入硼酸，花粉萌发率出现先升高后下降的趋势。本试验结果表明：0.06 g·L-1硼酸+100 g·L-1蔗糖是花粉离体培养的最佳培养基，对花粉萌发有着明显的促进作用，花粉萌发率为63.22%。

表1 不同浓度的硼酸和蔗糖组合溶液对花粉萌发的影响

图3 不同培养时间对花粉萌发的影响

2.4 不同培养时间对花粉萌发的影响

在0.06 g·L-1硼酸+100 g·L-1蔗糖，温度为(25±1)℃条件下，离体培养1 h萌发率较低，在花粉培养 1 h后花粉管长度达到标准，萌发率有所增加，约在2 h左右花粉萌发达到第1个小高峰，萌发率由0增长到12.57%；在2～4 h萌发率基本保持不变，大约在15.88%；在4～6 h花粉萌发进入第1个快速增长阶段，在6 h的时候花粉萌发率由15.88%增长到41.94%，在6～8 h花粉进入第2个快速萌发阶段，并在8 h时达到第2个高峰，此时花粉萌发率高达62.86%；在8～12 h时萌发率趋于稳定，基本保持在63%，观察到花粉已基本完全萌发，所以花粉离体培养最适的镜检和统计时间为8 h(图3)。

2.5 不同贮藏条件下干花粉萌发率的变化趋势

在30，25，4，-18 ℃贮藏条件下，随着贮藏时间的不断延长，花粉内有机物质的不断消耗，花粉的萌发率呈现下降的趋势，但各贮藏条件下花粉萌发率的下降速度不一样，在30 ℃贮藏条件下下降最快，花粉萌发率在前3 d下降的最快，由62.59%下降至28.66%，在第12 d时已经下降为0；25 ℃条件下次之，花粉萌发率在前3 d保持在50%以上，7 d时为40.82%，此时花粉仍具有较高的活力，在第12 d时为29.87%，与新鲜状态下的花粉萌发率相比下降了32.72个百分点；4 ℃条件下下降速度减缓，花粉萌发率在第12 d时为59.70%，与新鲜状态下的花粉萌发率相比下降了2.89个百分点；-18 ℃条件下花粉萌发率的变化不太明显，第12 d的萌发率与新鲜状态下的花粉萌发率相比仅下降了1.70个百分点。而在-80 ℃条件下花粉萌发率保持稳定不变，第12 d与第1 d花粉的萌发率无显著差异(表2)。

表2 不同贮藏条件下的花粉萌发率 %

图4 湿花粉在25，30 ℃条件下的萌发率

2.6 湿花粉在25，30 ℃条件下萌发率变化的趋势

湿花粉在25，30 ℃条件下会随着时间的推移花粉萌发率不断下降，在30 ℃条件下7 h内由60.45%下降到50.58%，下降了9.87个百分点，在25 ℃条件下7 h内由60.45%下降到54.95%，下降了5.5个百分点(图4)。

3 结论与讨论

本次研究试验了不同培养和贮藏条件对‘凤丹白’牡丹花粉萌发的影响，用离体萌发的方式检验花粉活力。结果表明：(1)‘凤丹白’牡丹花粉的萌发率，随着培养液中蔗糖和硼酸质量浓度的升高呈先上升后下降的变化趋势，0.06 g·L-1硼酸+100 g·L-1蔗糖为最佳的培养基，离体培养8 h，花粉萌发率为63.22%。(2)‘凤丹白’牡丹花粉生活力在低温和超低温条件下能够长时间的保持，因此，低温条件可作为长期保存花粉的手段。(3)湿花粉含水量高，在高温条件下较干花粉更易失活，因此在保存花粉时，最好对花粉进行干燥处理，缓慢去除水分，如置于室内自然阴干或利用干燥剂去除花粉内多余的水分，并在低温条件下贮藏，以保持较高的花粉生活力。花粉萌发率会因环境条件的改变而发生变化，在液体培养基中添加适宜质量浓度的蔗糖和硼酸可以提高花粉萌发率。蔗糖一方面为花粉萌发提供营养物质，另一方面能够平衡花粉与培养液之间的渗透势。适宜的蔗糖质量浓度对花粉萌发生长和花粉管伸长起着促进作用，质量浓度过低，花粉壁会破裂，内容物散出；质量浓度过高，则会造成花粉质壁分离，抑制花粉萌发生长[9]。适宜的硼酸质量浓度对花粉的萌发和花粉管的伸长有一定的促进作用[10]。崔晓龙等[11]认为，硼与糖结合后能极大地提高花粉萌发率。杨晓冬等[12]认为，硼离子能够促进糖在植物组织中的运输和代谢，而且硼离子对促进花粉管壁的形成也有一定的作用。董兆磊等[13]认为，在牡丹花粉萌发过程中硼酸起着显著的促进作用，但当蔗糖质量浓度过低不能满足花粉萌发的营养物质需求时，硼酸对促进牡丹花粉萌发作用不显著，在蔗糖质量浓度偏高的情况下，加入硼酸会在一定程度上抑制花粉的萌发，硼酸质量浓度过高或不加硼酸会导致花粉萌发率低，萌发速度慢，花粉管长度短以及花粉管形状不规则等一系列非正常状态。当离体培养时间较短时，花粉未完全萌发，此时的萌发率与真实萌发率相比较低。当离体培养时间较长时，花粉虽已完全萌发，花粉萌发率接近真实萌发率，但此时由于花粉管长度过长影响了观察效果，反而会增加统计难度，同样不适合作为最佳观察时间。因此，离体培养8 h就可以镜检观察花粉萌发情况，这与秦瑶等[1]的研究结果一致。此时的花粉生活力接近自然条件下的生活力，能够为杂交育种提供理论依据。在-80 ℃贮藏条件下，花粉萌发率在12 d中基本保持不变，主要是因为花粉在超低温贮藏条件下，花粉呼吸减弱，消耗的营养物质较少，能够保持较高的生活力[14]，李泽迪[15]的研究结果表明：超低温保存技术是花粉进行长期保存的有效方式。花粉生活力下降最快是在30 ℃条件下，施江等[16]认为，温度过高会导致花粉脱水死亡，同时高温度增强了花粉内部呼吸强度，从而消耗过多的营养物质，最终导致花粉生活力快速下降，不适合贮藏。比较这5种贮藏条件可以看出：花粉生活力都呈下降趋势，原因可能是花粉在贮藏的过程中，随着时间的延长花粉细胞内物质消耗过多，酶活性下降，水分严重缺乏。同时，花粉含水量的高低也会直接影响到花粉的活力，含水量高的花粉呼吸作用旺盛，细胞内的营养物质会被很快消耗，花粉生活力快速下降，而含水量适宜的花粉代谢缓慢，减少了营养物质的消耗，并能在这种条件下长期保持生活力。在花粉贮藏过程中温度和湿度是影响花粉生活力的2个重要的环境因素，想要使花粉长期保持生活力需对花粉进行低温和干燥处理。花粉在低温或者超低温条件下贮藏时，低温条件会影响花粉内部的呼吸作用和代谢过程从而导致花粉内酶的活性随着贮藏时间的推移而发生相应的生理生化反应[17，18]，各种代谢过程减慢，从而延长了花粉的贮藏寿命。当温度过高或过低时，对花粉生活力都会产生不利的影响[17]。