四季海棠无性系变异离体筛选与变异频率控制

翟懿铭， 雪文晶， 张 黎

（宁夏大学农学院，宁夏银川 750021）

四季海棠（begonia semperflorens）又名四季秋海棠、蚬肉海棠，适合在潮湿、半阴、温暖的环境中生长[1]。因其具有花色艳丽、花期长等特点，是优良的园林观赏植物和家庭观赏花卉。四季海棠通常采用播种与扦插方法繁殖，两种繁殖方法出苗率不易控制，随着繁殖次数的积累，后代品质逐渐降低、株型变异、叶色变化，抗性变差。四季海棠无性系建立是进行种苗快速繁殖的有效方法之一[5]，而四季海棠品种无性系建立过程中，也会有一定变异性状的出现。无性系变异的发生，严重影响了应用组培技术进行快繁的产业化生产效益[2]。变异苗观赏性及再生能力差，采用无性提纯的方法剔除变异植株，筛选优质种苗。目前，对四季海棠组培苗变异的研究空白，但变异在建立无性系过程中日益突出的不利影响逐渐显现，组培变异的筛选和控制显得愈加重要。

1 材料与方法

1.1 材料

以四季海棠（铜叶猩红色Bronze Scarlet）组培继代试管苗为试验材料，选取生长健壮的继代组培苗和具有明显特征的变异组培苗。

1.2 试验方法

1.2.1 四季海棠继代增殖培养出现的变异类型 选取四季海棠的茎段作为试验材料，进行继代增殖培养。以MS 为基础培养基，pH 调至6.5，剪除瓶苗气生根，将茎段切为长1.5～2.5 cm 小节，接种于增殖培养基，每瓶接种2～3 株。将增殖的丛生无菌芽苗再次分割、继代。培养条件（光照24 h/d，温度（26±2）℃，光照强度2 400 lx）。观察四季海棠的外观形态并进行数据采集，统计四季海棠出现的变异类型。

1.2.2 继代次数对四季海棠变异的影响 将四季海棠继代増殖培养第4 代至第10 代的标准苗，分别转接于MS 培养基中进行继代培养，每瓶接种2 株，每处理接种50 瓶，重复3 次，培养条件（光照24 h/d，温度（26±2）℃，光照强度2 400 lx），90 d 后统计变异率。

1.2.3 继代周期对四季海棠变异的影响 将生长30、60、90 d 的标准苗分别转接于 MS 培养基中，每瓶接种2 株，每处理接种50 瓶，重复3 次，培养条件（光照 24 h/d，温度（26±2）℃，光照强度 2 400 lx），90 d 后观察继代周期对四季海棠无性系变异影响。

1.2.4 提纯复壮试验设计 取继10 代的乔化变异苗和矮化变异苗，设置变异苗的继代周期为30、60、90 d，分别接种于MS 继代培养基培养，每个处理接种20 瓶，3 次重复。培养条件与继代培养条件一致，90 d 后统计四季海棠组培变异苗的复壮率。

1.3 统计与处理

增殖率=总芽数/存活外植体数，

变异率=出现变异的植株/存活总数，

叶面积：长乘宽叶面积系数法。

使用 Excel、DPS、Origin 进行相应的数据处理，实验采用单因素实验方法，进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 四季海棠组培苗变异类型

由表1 可知，四季海棠继代培养中，随着继代次数的增加，出现两种变异现象：叶片变小、节间变长，植株细长弯曲，生长迅速，为乔化变异株；植株矮小、叶柄间距变、叶面积小、长势差、生长缓慢、叶片少且变形，为矮化变异株。

2.2 四季海棠组培苗正常苗和变异苗性状差异

由表2 可知，变异对株高的影响，乔化、矮化苗与标准苗之间有显著差异；变异对于叶片数的影响，标准苗与乔化苗之间差异显著，乔化苗与矮化苗之间差异不显著；变异对茎径的影响，乔化变异与矮化变异之间无显著差异，与标准苗之间差异显著；各处理增殖数之间差异显著，标准苗、矮化变异苗、乔化变异苗之间差异显著。变异对节数的影响，乔化变异与矮化变异之间差异显著，乔化变异苗与标准苗之间差异显著，矮化变异苗与标准苗之间差异显著；变异对鲜质量的影响，标准苗、乔化变异苗之间差异不显著，标准苗、矮化变异苗之间差异显著，乔化变异苗，矮化变异苗之间差异显著。

2.3 继代次数对四季海棠组培苗变异的影响

由图1A 可知，继4 代开始，组培苗出现矮化和乔化两种变异。随着继代次数的增加，两种类型的变异率均增加，矮化变异率高于乔化变异率，总变异率上升。

图1B 表明，继1-4 代四季海棠无变异，继5 代出现变异，并且变异率呈上升趋势，继9 代达到最大值。继4 代至10 代范围内，总变异率随时间的变化拟合直线回归方程y=0.9x-0.27，变异率与继代次数具有密切正相关性，相关系数r=0.448 3。

图 1C 表明，继4 代至继 10 代范围内，两种不同类型的变异苗总变异率上升。

图1D 表明，乔化变异苗变异率的变化拟合直线回归方程y=0.39x- 0.07，变异率与继代次数具有密切正相关性，相关系数r=0.996 2;矮化变异苗变异率的变化拟合直线回归方程y=0.53x-0.02，变异率与继代次数具有密切正相关性，相关系数r=0.960 3。

2.4 继代周期对四季海棠组培苗变异频率的影响

由表3 可知，继代周期不同，四季海棠组培苗的变异率有所不同。继代30 d 时，组培苗生长速度快，长势好，叶片发育正常，增殖系数高；继代90 d，组培苗生长慢，茎变细弱，并出现变异。继代时将变异苗变异部分剔除，同时转入新培养基，继续培养，但变异性状未改变。

由表4 可知，乔化苗与矮化苗中，继代周期的变异率差异显著。变异率随着继代周期的延长而增加，缩短而降低。

表1 四季海棠变异苗类型

表2 四季海棠组培苗标准苗和变异苗性状差异

表3 继代时间对四季海棠组培苗变异频率的影响

图1 继代次数对组培苗变异率的影响

表4 继代周期对四季海棠组培苗变异频率的影响

2.5 四季海棠变异组培苗提纯复壮试验

2.5.1 四季海棠矮化变异组培苗提纯复壮 由表5可以看出，处理天数对矮化变异苗的影响。株高30 d与 90 d 之间差异显著，30、90 与 60 d 之间差异不显著；处理天数对茎径的影响，30、60、90 d 之间无显著差异；各处理节间长之间差异较大，标准苗，矮化变异苗，乔化变异苗之间差异显著；变异对节数的影响，乔化变异与矮化变异之间差异显著，乔化变异苗与标准苗之间差异显著，矮化变异苗与标准苗之间差异显著。随着处理天数的增加，复壮率呈现下降趋势。

2.5.2 四季海棠乔化变异组培苗提纯复壮 由表6可知，处理天数对乔化变异苗的影响，株高30 d 与90 d 之间差异显著，30、90 与60 d 之间差异不显著；处理天数对茎径的影响，30 d 与60 d、90 d 之间差异显著，60 d 与90 d 之间无显著差异。节间长30 d 与90 d 之间差异显著，30、90 d 与 60 d 之间差异不显著；节数 30 d 与 90 d 之间差异显著，30、90 d 与 60 d之间差异不显著；随着处理天数的增加，复壮率下降。

表5 四季海棠矮化变异组培苗提纯复壮

表6 四季海棠乔化变异组培苗提纯复壮

2.5.3 四季海棠变异组培苗提纯复壮效果比较 由表7 可知，将乔化变异株和矮化变异株分别接种于MS 培养基中培养，乔化变异率在提纯后，正常苗率为46.6%，乔化变异苗率为53.4%，无矮化变异株出现，表明乔化变异株提纯复壮有效。矮化变异株提纯复壮后正常苗率为0.66%，矮化变异苗率为93.4%，无乔化变异株出现，表明无效。

表7 四季海棠变异组培苗提纯复壮效果比较

2.6 四季海棠在继代过程中的性状筛选

由表8 可知，培养30 d 时，标准苗、乔化变异株和矮化变异株之间株高无显著性差异；生长60 d时，标准苗与乔化变异苗平均株高间差异不显著，标准苗、乔化变异苗与矮化变异苗差异显著；生长90 d 时，三者平均株高间差异显著；标准苗生长90 d平均株高10.704 cm，比矮化苗平均值高出58.8%，比乔化苗矮41.23%；标准苗生长60 d 平均株高4.68 cm，比矮化苗平均值高出13.2%，比乔化苗矮3.1%。矮化变异株在生长60 d 后停止生长，乔化变异株在生长90 d 内与标准苗相比增值速度快38.36%，两者为被筛选对象。

3 讨论与结论

3.1 讨论

前人对四季海棠的研究主要集中在组培快繁体系的建立[5]和大棚繁育[1]方面，未见有对组培阶段变异的研究报道，本试验以四季海棠组织培养增殖阶段组培苗为试验材料，采用单因素随机区组试验，探究四季海棠继代次数、继代周期对变异的影响以及提纯复壮。胡盼盼等[2]、张馨宇等[3]总结了草莓组培中变异发生的原因和有效控制变异的途径，指出组培过程中变异的普遍性，显著影响植物的遗传稳定性，制约了组培技术在农业生产上的应用。韦家川等[4]研究了香蕉试管苗增殖阶段中出现的变异类型，表明变异与品种、继代培养时间、培养条件有关。曾少玲等[7]研究了代数、激素使用和分化途径对香蕉生长的影响，表明香蕉无土栽培的继代代数不宜超过10 代。张盛圣[6]指出，继代次数对绿萝的叶色变异有显著影响，而且对发生变异的植株剔除，对其进行分离提纯有利于植株继代变异率降低且能够持稳定、较低的变异率。王安石等[8]研究了红掌组培苗工厂化生产的变异控制技术，指出控制组培体系的变异需要从外植体选择到继代培养各个环节严格把控，这与本试验继代次数对四季海棠组培苗的变异影响相符。对无性系变异筛选及调控途径的研究，将有可能揭开表观遗传变异的真相，为如何有效控制组培变异和减少变异对生产的不利影响提供更多切实可行的途径。

表8 四季海棠组培苗不同培养天数下株高差异显著性

3.2 结论

（1）四季海棠组培苗变异类型为乔化变异和矮化变异两种，乔化变异率为2.9%，矮化变异率为3.8%；

（2）四季海棠组培苗继代4 次后，出现变异现象，变异率随继代次数增加而增加。

（3）四季海棠组培变异率随着继代时间增加而增加。

（4）四季海棠变异组培苗乔化变异提纯复壮率达46.6%，矮化变异复壮为0.66%。