146例非免疫性水肿胎儿的产前染色体分析

侯 磊,王小新,李介岩,刘丽恒,张为远,王 欣

(首都医科大学附属北京妇产医院产科，北京 100026)

胎儿水肿是指胎儿软组织水肿及体腔积液，超声表现为两处及两处以上的胎儿体腔异常积液，包括胸腔积液、腹腔积液、心包积液及皮肤水肿。胎儿水肿包括免疫性胎儿水肿与非免疫性胎儿水肿(nonimmune hydrops fetalis,NIHF)，其中非免疫原因占胎儿水肿原因的85%以上，发病率约为3/10000[1]。关于NIHF的诊治，2014年美国母胎医学学会发布了相关指南[2]，2017年我国于《中华围产医学杂志》发布了相关指南[3]，其病因均首先提到染色体异常。染色体异常占NIHF病因的25%～70%[4]，特别是在妊娠早期发现水肿或并发其他胎儿结构异常时，胎儿非整倍体的风险更高[5]。Santo等[6]研究显示，24孕周前诊断的NIHF中，约50%的病因是染色体非整倍体异常，Turner综合征及21-三体发病率最高，约占水肿胎儿的13%，其次18、13及其他染色体三体也可导致胎儿水肿。2018加拿大指南与2014美国母胎学会指南均建议所有水肿胎儿查胎儿染色体，不推荐行无创母血胎儿染色体筛查。与以往指南不同的是，2018加拿大指南更强调对水肿胎儿致病性拷贝数变异(copy number variants,CNVs)的检查。胎儿水肿的大样本CNVs检测研究较少，致病性CNVs检出率差异较大，Su等[7]研究显示，水肿胎儿的致病性CNVs检出率为8.3%(3/36)。张志坚等[8]研究显示，46例水肿胎儿中，染色体异常检出25例，其中12例为致病性CNVs，检出率达26.1%。本文对146例非免疫性水肿胎儿进行了核型联合低覆盖度大规模平行测序技术(CNV sequencing，CNV-Seq)的检测，以明确水肿胎儿异常CNVs检出率。

1 资料与方法

1.1 研究对象 回顾分析2013年1月1日至2016年12月31日于首都医科大学附属北京妇产医院产前诊断中心就诊，胎儿超声提示胎儿水肿且间接Coombs实验除外免疫性胎儿水肿的146例孕妇的临床资料，如患者一般情况、超声结果等。

1.2 方法

1.2.1 组织送检 (1)绒毛诊断:妊娠11～13+6周经腹活检取绒毛4～5mg；(2)羊水诊断:妊娠18～23+6周经腹羊膜腔穿刺取羊水30ml；(3)脐血诊断:妊娠24周后经腹脐静脉穿刺取血2ml；(4)胎儿组织送检:死胎流产后取胎儿皮肤组织0.5cm3。既往研究显示，CNV-Seq与微阵列技术有较好的一致性，且CNV-Seq需要样本量较小，适用于取样量较小的绒毛标本，因此本研究采用CNV-seq作为CNVs的检测方法。绒毛及胎儿组织标本送检CNV-Seq，羊水及脐血标本除CNV-Seq外还送检核型。介入性产前诊断均在超声定位下进行，按常规方法进行细胞培养、收获、制片及核型分析。孕妇术前常规遗传咨询并签署知情同意书。羊水穿刺、脐带血穿刺及绒毛穿刺均由本院产前诊断中心完成，送检单位为本院遗传实验室。CNV-seq检测外送至贝瑞和康公司。

1.2.2 CNV-Seq 将50ng基因组DNA进行片段化处理，获得平均大小为300bp的DNA片段，参考文献构建测序文库[9-10]，使用Illumina公司的HiSeq 2000平台进行测序，36bp单端测序，测序深度0.1倍，产生800万条测序序列。使用Burrows-Wheeler算法将所有测序序列与hg19基因组进行比对分析[11]。根据文献记载的数据处理和分析算法[12]，将最少20个测试样本进行内部比较，互相作为参考。为了提高检测灵敏度，以60kb为基本测序单元，对约500万条测序序列进行分析。以标准化测序读取密度的log2值为y轴，以相对连续的60kb测序单元为x轴，绘制CNV-seq检测结果图。依据每条染色体的长度计算log2平均值。染色体拷贝数重复(3个拷贝)的log2理论值为log2[1.5]=0.58，染色体拷贝数缺失(1个拷贝)的log2理论值为log2[0.5]=-1.0。将CNV-seq检测拷贝数重复的cut-off值设为>2.8(log2[1.4]=0.49)，拷贝数缺失的cut-off值设为<1.2(log2[0.6]=0.74)。

数据查询DGV、DECIPHER、OMIM、UCSC及PubMed公共数据库资源。致病性CNV根据美国医学遗传会与基因组学会(ACMG)诊断标准，将CNVs分为3大类5级:(1)致病性CNVs(pathological copy number variations，pCNVs)；(2)良性CNVs；(3)临床意义未明的CNVs；(4)可能致病性CNVs；(5)可能良性CNVs[13]。

1.2.3 数据收集 核对研究对象的一般情况、超声结果及遗传室结果并录入电脑，整理分析其临床信息。

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0软件，计数资料采用频数及率描述，率的比较采用卡方检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般情况 146例水肿胎儿的产前诊断方法包括绒毛穿刺57例，羊水穿刺68例，脐血穿刺11例，死胎流产后送检胎儿组织10例；孕周为11～33周，中位数孕周为15周。146例水肿胎儿的染色体异常发生率为48.6%(71/146)，其中性染色体异常数量最多，为29例，21-三体19例，18三体13例，13-三体3例，其他染色体异常1例，致病性CNVs 6例(表1)。其他染色体异常1例，系38岁孕妇，13周因胎儿水肿、颈部水囊瘤行绒毛穿刺，46，XN，del(5)(p15,33)。

2.2 不同孕周水肿胎儿的染色体异常检出 水肿胎儿的染色体异常检出率随孕周的增加而显著降低，<14孕周、14～27孕周、≥28孕周孕妇的染色体异常检出率分别为68.4%(39/57)、40.8%(31/76)和7.7%(1/13)(表1)。

表1 不同孕周水肿胎儿的染色体异常检出

2.3 水肿胎儿并发其他超声异常的染色体异常检出 水肿胎儿最常合并的超声结构异常依次为NT/NF增厚、颈部水囊瘤及心脏异常，其染色体异常的检出率分别为59.5%、59.2%及51.9%(表2)。

表2 水肿胎儿并发其他超声异常的染色体异常检出

2.4 水肿类型与胎儿染色体异常的检出 146例水肿胎儿中，单纯性皮肤水肿114例，皮肤水肿并发胸水15例，皮肤水肿并发腹水3例，皮肤水肿并发心包积液1例，皮肤水肿并发胸腹水13例，胸腹水1例；染色体异常检出率分别为51.8%(59/114)、40.0%(6/15)、33.3(1/3)、0%(0/1)、38.5%(5/13)、0%(0/1)。

2.5 水肿胎儿的CNVs检出情况 146例标本中共检出致病性CNVs 6例，CNV-Seq额外增加4.1%的染色体异常检出(表3)。6例CNVs包括Moyamoya disease 4综合征2例，Cri du chat综合征1例及chromosome 17p13.3 重复综合征1例，其余2例为10号染色体重复及Y染色体的缺失(表3)。

1例临床意义未明病例，32岁孕妇，因NT 4.8mm、胎儿水肿于孕12周行绒毛穿刺，结果提示3p12.1(85100001-86140000)存在重复，重复片段大小为1.04Mb，经查询DGV、DECIPHER、OMIM、UCSC以及PubMed公共数据库资源，未找到与该片段相关的明确致病信息和文献报道，临床意义未明。

表3 水肿胎儿致病性CNVs病例

3 讨 论

本研究结果显示，水肿胎儿染色体异常发病率最高的是性染色体异常，共29例，其中26例为Turner综合征，2例为Turner综合征嵌合:45,X(40%)/46,XN(60%)及45，X(40%)/46，XY(60%)，1例为46，XX(25%)/46，XY(75%)。本研究发现的CNVs异常中也有2例为X染色体片段缺失，称Moyamoya disease综合征。以上均提示X染色体缺失是最常见的导致胎儿水肿的病因。Laterre等[14]研究显示，33例染色体异常中Turner综合征或嵌合型Turner综合征18例，Turner综合征的水肿从胎儿期延续到婴儿期，婴儿期淋巴管水肿的发生率97%，多表现为手足背水肿[15]。X染色体短臂上有淋巴管生成基因，邻近Xp21.2～Xp21.1，推测Turner胎儿同源基因的不充足使淋巴管发育不良，产生淋巴水肿，水肿的机械力作用于淋巴系统邻近的组织或器官，影响其发育而导致器官的畸形[16]。

本研究显示，21-三体是除性染色体异常外导致胎儿水肿的最常见原因，共发现19例，检出率为13%，与以往研究一致。Mardy等[17]研究发现1例21号染色体微重复的水肿胎儿(21p11.2q22.3)，提示21号染色体与水肿的产生关系密切。有学者认为，21-三体胎儿多合并心脏畸形，心脏畸形导致循环障碍从而引发水肿。但本研究中19例21-三体胎儿中，只有2例超声提示心脏结构异常，因此21-三体导致水肿的机制尚需进一步研究。

以往研究报道涉及胎儿水肿的CNVs异常包括Miller-Dieker 综合征、Pena-Shokeir、Digeorge综合征、5P-综合征等[18]。在染色体及CNVs无异常的病例中，尚需除外单基因病，如代谢病及RAS通路疾病等，RAS通路疾病是涉及丝裂原活化蛋白激酶信号通路(RAS-MARK)中的PTPN11、BRAF等16个基因的一组单基因病，胎儿表现为颈部半透明增厚和(或)水囊瘤、羊水过多、胎儿水肿、心脏缺陷和肾脏异常，其中Noonan综合征是最常见的疾病，有研究对95例核型及CNVs无异常的上述表型胎儿进行基因检测，检出Noonan综合征10例[19]。

综上所述，染色体病仍是非免疫性水肿胎儿中常见的原因，特别是孕14周前的水肿胎儿。致病性CNVs在水肿胎儿中占有相当的比例，在产前诊断中须重视此项检测。