微量元素指纹分析在地理标志产品绍兴黄酒鉴别中的应用

王佳丽 陈嘉玲 陈光倩 彭 祺, 傅建伟

(1.绍兴文理学院 生命科学学院，绍兴黄酒研究院，浙江 绍兴 312000;2.国家黄酒产品质量监督检验中心，浙江 绍兴 312071;3.国家黄酒工程技术研究中心分中心，浙江 绍兴 312000)

0 引言

1999年，原国家质量技术监督局发布了《原产地域产品保护规定》，标志着有中国特色的地理标志产品保护制度的初步确立.2000年，绍兴酒成为中国第一个受到保护的地理标志产品，即地理标志保护产品.2005年7月15日起颁布实施的《地理标志产品保护规定》对地理标志产品实施了专门保护[1].地理标志产品由于其特殊的经济意义和商业价值，给使用者、使用地区带来了竞争优势和经济财富，是其品牌建设和发展的重要砝码，其保护价值愈发凸显[2].但是国内对地理标志产品的保护仍停留在健全法制的层面，对使用检测手段来区分地理标志产品与非地理标志产品的研究并不多见.课题组分析借鉴了国内外同行的研究经验[3-8]，结合绍兴酒的实际，探索通过元素分析与多元统计分析方法结合建立指纹数据库来鉴别和保护地理标志产品-绍兴酒(GB/T17946).

黄酒产区众多，主要产区有浙江、上海、江苏，此外还有众多边缘产区，例如安徽、福建、山东等地，不同产区的黄酒在品质上差别较大，即使是同一产区的黄酒，也存在较大差异.单就绍兴黄酒就可分为地理标志产品-绍兴酒(GB/T17946)和普通黄酒(GB/T13662). 地理标志产品-绍兴酒(GB/T17946)[9]中对地理标志产品绍兴酒的注释是：以优质糯米、小麦和保护范围内的鉴湖水为主要原料，经过独特工艺发酵酿造而成的优质黄酒.其中的主要原料鉴湖水、糯米和小麦带入的原料因素，产地的土壤、地质、气候等环境因素以及独特工艺发酵酿造等人为因素，决定了产品的品质及其特征和风格口感[10].

黄酒成分复杂，除了水和酒精，还有大量的无机和有机成分，如糖、有机酸、酚类化合物、氨基酸、金属元素等，所有这些化学物质对酒的品质、风味和口感都有重要影响.研究指出许多微量元素的浓度在发酵过程和澄清过程中减少；如Li，B，Mg，Ca，Rb，Cs，Pb在黄酒精化过程中变得微量；在另一项研究中[11]，许多元素的含量如Al，Co，Cr，Cu，Fe，Mn，Zn，Pb，V，Zn由于土壤净化可能会受到影响.元素不仅是酒中的重要组成部分，还关系到风味、口感和外观.黄酒中元素主要来源于发酵的原料，通过酵母和其他微生物协同发酵，将糯米和小麦中的淀粉、蛋白质和脂质分解为低聚糖、多糖、氨基酸、二肽和其他成分.与此同时，原料中的元素释放转入发酵产物，最后转移到成品酒.黄酒中元素的另一个重要来源是水.水不仅充当有机和无机物质的溶剂，还是黄酒的主要成分.此外，元素也可以产生于酿酒过程中的器皿、设备仪器等.因此，黄酒原料、水源和酿造过程酿造工艺的不同都会导致元素组成的差异.

基于地理标志产品的多样性和复杂性，元素是一个比较稳定的因素，且元素的含量与产品产区生态、土壤等条件密切相关，在产品中具有相对稳定的元素构成比例.且元素的测定方法较成熟，样品处理过程较简单，耗时较少.测定元素常用方法有原子吸收光谱法(AAS)、原子发射光谱法(AES)、电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)等[12-13].电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)仪器具有高效的样品分析能力和极高的检测灵敏度.ICP-MS以等离子体(ICP)作为离子源，通过质谱(MS)分析器检测产生的离子，可以同时测量元素周期表中大多数元素，测量分析物浓度可达到ng/L或万亿分之几(ppt)的水平.用元素分析建立快速鉴别地理标志产品有广泛应用空间.本文通过探究产区间存在明显差异的特征元素，利用专业分析方法来鉴别地理标志产品绍兴酒(GB/T17946)和普通黄酒(GB/T13662).

1 材料与方法

1.1 样品

本文根据水源和地域的不同，将研究对象分成三组：A组，地理标志产品绍兴酒(GB/T17946)40个；B组，普通绍兴黄酒(GB/T13662)40个；C组，非绍兴产区的黄酒(GB/T13662)40个.其中112个是半干型黄酒，8个是干型黄酒.所有的样品年份均为2014年，每个样品及存放容器都排除了外部添加物.

1.2 样品制备

1 mL酒样置于聚四氟乙烯微波消化管内，加入8 mL 68% (wt%)HNO3(优级纯)，2 mL 30% (wt%)过氧化氢(优级纯)，微波消解.消解程序见表1.微波消解后聚四氟乙烯微波消解罐置于加热电炉上(设定在140 ℃)挥发多余的硝酸，用2%(wt%)的HNO3定容至25 mL，同时设置空白样品.为防止污染，所有使用的器皿浸泡在20%(wt%)HNO3至少24 h，使用前用超纯水洗净.

表1 微波消解中的加热程序

1.3 仪器与试剂

电感耦合等离子体质谱仪7500a(美国安捷伦仪器有限公司)，仪器条件参数见表2；微波消解系统 MARS 6型(美国CEM公司)；超纯水：电阻率18.2 MΩ/cm(美国 Millipore 公司)；硝酸(优级纯)：美国Sigma-Aldrich公司；30% (wt%) 过氧化氢(优级纯)：国药集团化学试剂有限公司；混合标准储备液(国家标准物质研究中心)：K、Na、Ca、Mg、Fe(C=1.0 g/L)，Mn、Cu、Zn、Cr、Pb、Cd、Ba、Ni、Al、As(C=0.01 g/L)；混合标准使用液(国家标准物质研究中心)：K、Na、Ca、Mg、Fe(C=0.1 g/L)，Mn、Cu、Zn、Cr、Pb、Cd、Ba、Ni、Al、As(C=1.0 mg/L)；质谱调谐液(国家标准物质研究中心)： Li、Y、Ce、Tl、Co(C=10 μg/L)；内标溶液(国家标准物质研究中心)：Sc、Ge、In、Bi(C=0.01 g/L)，使用前用1% (wt%)的HNO3稀释为C=1 μg/L.

表2 检测时ICP-MS的条件参数

1.4 统计分析

方差分析(Analysis Of Variance，ANOVA)，是用于多个样本均数差别的显著性检验.从观测变量的方差入手，研究多个控制变量中哪些变量是对最终研究对象有显著影响的变量.分析时排除一些极端的离群值.计算检查F值，筛选出研究对象中有统计意义的明显差异变量.

主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)，是一种掌握事物主要矛盾的统计分析方法，在力保数据丢失最少的原则下，对多变量的数据进行最优综合性精简，对高维的变量进行降维处理，从多元事物中解析出主要影响因素，简化复杂问题，揭示事物本质[14-15].

线性判别分析(Linear Discriminant Analysis，LDA)，是将高维的模式样本投影到最佳鉴别矢量空间，达到分类数据信息和降低特征空间维度的效果，模式在最终空间内达到最佳分离性，是一种有效的特征抽取方法[16].

偏最小二乘法-判别分析(Partial Least Squares-Discriiminate Analysis，PLS-DA)，是一种对多组变量进行建模的多元统计数据分析方法.它既是一种特征抽取方法，又是一种回归分析模型.通过抽取潜在信息，对包含多因变量的数据进行建模分析[17-18].

2 结果与讨论

2.1 微量元素数据分析

对三组黄酒样品中16种微量元素(Na，Mg，Al，Cr，As，Cd，Pb，K，Ca，Mn，Ni，Cu，Zn，Fe，Se，Ba)进行测定，含量见表3，测定结果进行方差分析，结果显示三组样品中Mg，K，Ca，Mn，Zn，Fe这6种元素的含量有明显差异，A组绍兴酒中Mg，K，Ca，Mn，Zn元素含量明显高于B组和C组.

2.2 主成分分析(PCA)结果

对不同组别的黄酒元素数据进行PCA分析，获得较为直观的结果(图1)，除个别酒样存在离群外，将A组、B组和C组有效的划分，可以初步区分地理标志产品绍兴酒(GB/T17946)和非地理标志产品黄酒(GB/T13662).同时主成分分析获得的结果只是初步的，需要利用LDA和PLS-DA分析进一步提高分离度.

表3 绍兴酒与普通绍兴黄酒及非绍兴产区黄酒中16种元素的含量

图1三组黄酒样品PCA分析(a)和PLS-DA分析(b)结果图

2.3 LDA和PLS-DA分类结果

利用LDA和PLS-DA来分类样品和构建模型[17-18]，其中81个(A、B、C组各27个)为校准样本集，39个(A、B、C组各13个)为预测样本集.校准样本集和预测样本集的样品均为随机选取.通过LDA和PLS-DA进行数据处理分析，分离不同组别的样品，构建模型. 结果如表4，仅有2个样品出现偏差，准确率高达94.9%.图1(b)是在PCA分析处理的基础上，利用PLS-DA分析处理达到高度分离的结果，将3个组别的样品清晰地划分.

表4 利用LDA和PLS-DA分析区分3个组别黄酒

3 结论

本文通过微量元素组成测定，结合方差分析和主成分分析不同组别样品间的内部差异，利用线性判别分析(LDA)和偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)分类和建立模型，实现利用黄酒中微量元素的指纹识别来区别不同产区黄酒，正确率高达100%和94.9%.不同产区黄酒差异的主要因素为原材料(主要是酿造水)和酿造工艺.总体来说，可以得出结论：微量元素指纹识别可以作为有效工具来区别和保护地理标志产品-绍兴酒.然而，这只是一个可行性研究.在进一步研究中还需扩大样品的采集数量，分类建立不同酒厂的元素数据库，建立模型，不断扩充和更新数据库，为保护地理标志产品-绍兴酒，提供科学、快速的鉴定检测方法.