荷叶总黄酮提取工艺及其抗氧化性研究

范业刚，曹利慧

（衡水学院化学化工学院，河北衡水053000）

荷叶属睡莲科植物莲的叶片，是国家卫生部公布的既是食品又是药品的植物。荷叶中富含多种具有生物活性的成分，如荷叶精油、荷叶生物碱、荷叶多糖及荷叶黄酮等，其中荷叶黄酮是其主要活性物质。报道显示，黄酮类化合物对治疗血管病有很好的效果，具有抗氧化、稳固血管、疏通血管、防止高龄人的血压疾病等功效，对身体代谢和人体免疫也有重要作用。所以，针对影响荷叶总黄酮提取的因素进行研究，选择优良的提取工艺，提高荷叶总黄酮的提取率，研究其总黄酮抗氧化性，对人体健康保护具有重要意义。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

荷叶样品，河北衡水湖；无水乙醇、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠、硫酸亚铁、HO、水杨酸，均为分析纯；芦丁对照品，含量98.7%，化学标准品，上海金穗生物科技有限公司。

722型可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司；FA2004B型电子天平，上海衡平仪器仪表厂；FW100型高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；80-2型高速离心机，金坛市国旺实验仪器厂；BL6-180A型超声波清洗机，上海碧浪仪器有限公司；SHB-Ⅲ型循环水式真空泵，郑州长盛实验仪器有限公司；GZH-DH-X型电热恒温干燥箱，郑州宏朗仪器设备有限公司。

1.2 薄荷叶总黄酮提取的单因素实验

将风干的荷叶置于干燥的粉碎机，粉碎4 min 后，过60 目分样筛，得到所需荷叶样品，储存于密封容器中，待用。

荷叶中总黄酮的提取流程：预处理后的荷叶粉→加入乙醇→超声提取→冷却至室温→离心→收集上清液→测吸光度→计算黄酮含量。

1.2.1 料液比对总黄酮提取率的影响

准备75%乙醇溶液，电子天平称量1.00 g处理备用的荷叶粉末，依据料液比1∶6，1∶8，1∶10，1∶12，1∶14 分别混合，实验时间25 min，温度45℃，进行总黄酮提取。然后将得到的提取液离心分离15 min（转速5 000 r/min），合并清液，用75%乙醇定容至25 mL，取1 mL清液进行黄酮含量测定。

1.2.2 实验温度对总黄酮提取率的影响

准备75%乙醇溶液，用电子天平称量1.00 g处理备用的荷叶粉末，依据料液比1∶10 混合，实验时间为25 min，分别在温度为25℃、35℃、45℃、55℃和65℃的实验条件下提取总黄酮。然后将得到的提取液离心分离15 min（转速为5 000 r/min），合并清液，用75%乙醇定容至25 mL，取1.00 mL清液进行黄酮含量测定。

1.2.3 不同乙醇浓度对提取总黄酮提取率的影响

用电子天平称量1.00 g处理备用的荷叶粉末，依据料液比1∶10，加入不同浓度（45%、55%、65%、75%、85%）的乙醇，实验时间为25 min，温度45℃，进行总黄酮提取。然后将得到提取液离心分离15 min（转速为5 000 r/min），合并清液，用75%乙醇定容至25 mL，取1.00 mL清液进行黄酮含量测定。

1.2.4 超声时间对总黄酮提取率的影响

准备75%乙醇溶液，用电子天平称量1.00 g处理备用的荷叶粉末，依据料液比1∶10 混合，超声温度45℃，超声提取时间分别为15 min、30 min、45 min、60 min、75 min。然后将得到提取液离心分离15 min（转速为5 000 r/min），合并清液，用75%乙醇定容至25 mL，取1.00 mL清液进行黄酮含量测定。

1.3 正交实验

表1 正交因素水平表

综合以上的单因素实验再次进行正交实验，以确定提取荷叶总黄酮的最佳实验方案。正交因素水平表见表1。

1.4 总黄酮含量测定

1.4.1 标准曲线的绘制

将10 mg 芦丁溶于75%乙醇中，小幅度地摇晃，静置后使用蒸馏水定容至10 mL，得到浓度为1 mg/mL 的芦丁标准品溶液。

取0.00 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00mL、1.20 mL 芦丁溶液放入20 mL 比色管中，量取1.0 mL浓度为5% NaNO溶液，加入试管，摇匀后静置8 min；量取1.0 mL浓度为10%的Al（NO）溶液，加入比色管，轻晃后放置8 min；量取10.0 mL浓度为5%的氢氧化钠溶液，加入比色管；向比色管中加入75%的乙醇至20 mL，轻晃，静置18 min。510 nm 处测定各溶液的吸光度，做出芦丁标准曲线。

1.4.2 黄酮含量的计算

准确量1.2 所得的清液1.0 mL，按以上步骤在510 nm 的位置检测其吸光度值。依照标准曲线，求出对应的黄酮浓度，依照公式计算黄酮含量。

式中：a—稀释倍数；c—黄酮浓度，mg/mL；V—提取液总体积，mL；W—甘草粉质量，g。

1.5 荷叶总黄酮的抗氧化性

1.5.1 对DPPH自由基的清除能力

（1）配制所需浓度的DPPH溶液

用95%乙醇溶液对0.011 2 g的DPPH进行溶解；将上述溶液加入到50 mL容量瓶中，加入95%乙醇溶液定容。

（2）测试DPPH自由基本身的吸光值A

取配好的DPPH 溶液2.00 mL 于试管中；移取2.00 mL的蒸馏水加入比色管，定容，轻晃，阴暗处静置18 min；测定溶液在510 nm位置的吸光值A。测试3次，取均值。

（3）测定加入黄酮后溶液的吸光值A

将不同浓度的样品溶液2.00 mL 用移液管移至试管中；取配好的DPPH溶液2.00 mL，加入比色管，定容，轻晃，背光处放置18 min；测定510 nm 处的吸光值A。重复进行3次，取平均值。

（4）测试黄酮本身的吸光值A

分别将不同浓度的样品溶液用移液管移取2.0 mL至不同试管中；量取2.0 mL 蒸馏水放入比色管，定容，轻晃，阴暗处放置18 min；测定510 nm 处的吸光值A。重复进行3次，取平均值。相同步骤测定相同浓度V标准液的清除能力为对照。

（5）计算DPPH·清除率：

1.5.2 对羟自由基（·OH）的清除作用

1.5.2.1 测试羟自由基本身的吸光值D

（1）量取2.00 mL蒸馏水放入比色管。

（2）量取2.00 mL 浓度为6 mmol/L 的FeSO溶液，加入比色管后摇匀，放置15 min。

（3）量取2.00 mL 浓度为6 mmol/L 的水杨酸，加入比色管后摇匀，放置15 min。

（4）量取2.00 mL HO溶液，加入比色管摇匀，放置15 min。

（5）测出溶液在510 nm下的吸光度值，记为D。

1.5.2.2 测定将荷叶黄酮提取液加入到羟自由基后溶液的吸光值D

将1.5.2.1（1）中2.00 mL 蒸馏水换为2.00 mL 不同浓度的荷叶提取液，按照1.5.2.1 的实验流程，测出加入提取液后溶液的吸光度，记为D。

1.5.2.3 测试不同浓度荷叶提取液本身的吸光值D

1.5.2.4 相同步骤配制相同浓度的V标准液为对照

1.5.2.5 计算羟自由基的清除率

2 结果与讨论

2.1 芦丁标准曲线及回归方程

图1 芦丁标准曲线

根据图1 可看出，样液浓度与吸光度值在0～80 mg/L 之间成正比，有良好的线性关系，样液浓度越高，吸光值越大。

2.2 单因素实验结果

图2 料液比对黄酮含量的影响

2.2.1 料液比对总黄酮提取率的影响从图2看出，料液比增大，黄酮含量缓慢增加，并且料液比为1∶10时黄酮含量最大，为1.45 g/100 g；当料液比继续增大时，黄酮含量不再增加，反而减小。这是因为，当荷叶粉末的量不变，乙醇的量不断增大，黄酮与乙醇接触的可能性变大。当黄酮完全溶解时，黄酮含量为定值，乙醇的量仍旧增大，从而出现沉淀，使黄酮含量减小。

2.2.2 实验温度对总黄酮提取率的影响

图3 温度对黄酮含量的影响

由图3 可见，黄酮含量随着温度的增高而增加，并且在实验温度为45℃时黄酮含量达到最大，为1.28 g/100 g。当实验温度超过45℃时，随着温度的升高黄酮含量不再增加，而是呈现下降趋势。这是因为从热动力学角度来看，温度升高会加速物质的运动，还会加速溶剂与被提取物之间的物质交换，从而提高荷叶总黄酮的析出；但是黄酮本身具有还原性，温度过高会导致黄酮类化合物发生水解反应，所以荷叶总黄酮的析出减少。

2.2.3 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响

由图4可见，乙醇浓度为75%时，黄酮含量最高，为1.56 g/100 g，乙醇浓度更高时，黄酮含量下降。造成这个现象的原因可能是因为在一定范围内所用乙醇浓度越大，溶剂极性就越小，而且黄酮类物质极性偏低。根据相似相溶原理，溶剂极性小有利于荷叶总黄酮类化合物的析出；但是当乙醇浓度超过一定范围时，溶剂的极性不再减小，反而增大，所以荷叶总黄酮的析出减少。

图4 溶剂浓度对黄酮含量的影响

图5 超声时间对黄酮含量的影响

2.2.4 超声时间对总黄酮提取率的影响由图5 可见，随超声时间增加黄酮含量逐渐上升。 60 min 时，黄酮含量出现峰值1.55 g/100 g。时间延长，黄酮含量下降。因为提取初期，超声时间长利于荷叶总黄酮的析出，但是时间过长，加热导致黄酮类化合物水解，黄酮含量下降。

2.3 最佳工艺条件优化

表2 超声波提取法正交实验结果

根据正交表排列，进行正交实验，得到表2 所示结果。由表2 可知，影响总黄酮提取率的4 种因素的影响程度为：D＞B＞C＞A，即：溶剂浓度、温度、料液比、时间。所以超声提取荷叶总黄酮最优的提取组合为：ABCD，即：提取溶剂为75%浓度的乙醇溶液，料液比选用1∶12（g/mL），超声时间为45 min，提取温度为45℃。

2.4 荷叶总黄酮抗氧化性研究

2.4.1 总黄酮对DPPH·清除能力测定

图6 总黄酮和VC清除DPPH的能力

由图6 可看出，荷叶总黄酮对DPPH 自由基的清除能力与总黄酮的浓度成正比例关系，当黄酮含量达到0.400 mg/mL 时，清除率达到了58%，相比较V浓度为0.400 mg/mL 时清除率偏低。由此可以得出，荷叶总黄酮对DPPH的清除能力比较强，稍弱于V。

2.4.2 总黄酮对羟自由基清除能力测定

由图7 看出，荷叶黄酮对羟自由基有一定的清除能力。随着荷叶总黄酮和Vc 质量浓度的增加，两种物质清除羟自由基的能力逐渐增加。当黄酮的浓度与Vc 浓度相同时，对羟自由基的清除率分别为52.9%、59.5%。由此可得荷叶总黄酮清除羟自由基的能力比Vc稍弱。

图7 总黄酮和VC清除羟自由基的能力

3 结束语

实验通过对超声波法提取荷叶总黄酮过程中的四种可能影响实验结果的因素进行研究与分析，并对总黄酮的抗氧化能力进行测定，得出四种因素对总黄酮提取含量的影响大小顺序为：乙醇浓度＞超声温度＞料液比＞超声时间。通过单因素与正交实验得出最佳的实验方案为：超声时间45 min，温度45℃，料液比1∶12（g/mL），乙醇浓度75%。荷叶总黄酮具有一定的抗氧化性，且抗氧化性随浓度的增大而增强，但比等浓度的V的清除能力要低，表明荷叶提取物可以作为有效的抗氧化成分来进行开发研究。