自然发酵锦州小菜中优良酵母菌的筛选及鉴定

李 默，曹凯欣，任广钰，张鹤男，姜锦惠，闫丹丽，乌日娜

（沈阳农业大学食品学院 沈阳110866）

锦州小菜是辽宁省锦州特色食品之一，是以黄瓜、茄子、辣椒、白菜等新鲜蔬菜经酱油、食盐、食醋、白糖等调味料腌渍而成[1-2]。传统锦州小菜由锦州当地居民采用自然发酵方式制作而成，小菜中富含大量发酵特性良好的天然微生物。孙慧君等[1]通过高通量测序对传统发酵锦州小菜中的微生物多样性进行分析，结果显示：从27 种锦州小菜样品中共检测到6 种已知细菌门和53 种细菌属，从22 种锦州小菜中共检测到4 种真菌菌门和20 种真菌菌属。主要的细菌菌属包括乳酸杆菌属（Lactobacillus）、蓝细菌属（Cyanobacteria_norank）、魏斯氏菌属（Weissella）、弧菌属（Vibrio）、葡萄糖杆菌属（Gluconbacter）等，主要真菌菌属包括毕赤酵母菌属（Pichia）、姆拉克酵母菌属（Mrakia）、镰刀菌属（Fusarium）等。这些微生物共同赋予锦州小菜优良的口感风味和营养价值。

在锦州小菜的发酵阶段，发挥主要发酵作用的微生物是乳酸菌和酵母菌，两者共同作用产生锦州小菜独特的风味成分和营养价值[3-4]。乳酸菌在发酵过程中主要发挥产酸作用，降低锦州小菜的pH 值，抑制杂菌生长，同时促进风味物质的形成[5]。乳酸菌还能产生一些代谢产物，如细菌素等，具有抑制杂菌生长的作用[6]，保障小菜品质安全。除乳酸菌外，锦州小菜中还富含多种优势酵母菌，酵母菌的生长主要存在于发酵蔬菜的主发酵和二次发酵阶段，甚至到碳水化合物被完全耗尽。酵母菌在发酵过程中能够产生醇类、酯类等风味物质[7-8]，赋予锦州小菜独特的醇香和酯香等香气成分[9]。目前，对锦州小菜中优势菌的研究主要集中在乳酸菌上[10-11]，忽视了能赋予其独特风味的酵母菌。

为从锦州小菜中获得优质的酵母菌，本研究以锦州当地4 个区市售的44 种锦州小菜为样品，对具有优良特性的酵母菌进行分离筛选和鉴定，以期为优良酵母菌发酵剂的挖掘提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验材料

1）样品的采集 用于本研究的试验样品采购于辽宁省锦州市的4 个区（凌河区、古塔区、太和区、松山新区），共采集44 份锦州小菜样品。其中凌河区6 份，古塔区19 份，太和区13 份，松山新区6 份。

2）培养基 孟加拉红琼脂培养基[12]、YPD 培养基[13]、麦芽汁培养基[14]、TTC 上层培养基[15]均为实验室配制。

1.1.2 试验试剂 TaqTM 聚合酶，大连TaKaRa公司；PCR 引物，上海派森诺生物科技有限公司；琼脂糖，生工生物工程（上海）股份有限公司；氯霉素、甲醛、硫酸铜、百里酚蓝、冰醋酸等均为国产分析纯级试剂。

1.2 仪器与设备

PB-10 pH 计，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；FA1004 分析天平，上海精科天平厂；DNP-9272 电热恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；Mini Pro 300V 电泳仪，上海力申科学仪器有限公司；ABI3730XL 测序仪，美国Applied Biosystems 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 酵母菌的分离 准确称取各样品25 g，与225 g 无菌生理盐水混合，充分振荡后进行梯度稀释，分别取200 μL 各样品稀释液，涂布于孟加拉红和YPD 固体平板，28 ℃培养24 h。观察菌落形态，挑取酵母菌相似单菌落，在孟加拉红固体培养基进行纯化，并将单菌落用亚甲基蓝染色后，显微镜镜检观察，将显微镜下相似酵母菌形态的菌株进行保藏并编号。

1.3.2 耐酸、耐胆盐特性 优良酵母菌应能够在人体肠道极端环境下存活，本研究检测了酵母菌菌株在酸（pH 3.0）和胆盐（0.3 g/100 mL）环境中存活情况，挑取保藏好的酵母菌菌株，接种于YPD液体培养基活化3 代，取第3 代活化菌株，做耐酸、耐胆盐试验。

1）耐酸特性 分别取100 μL 各活化菌液，接种于10 mL pH 值为3.0 的无菌YPD 液体培养基中，28 ℃条件下，分别培养0，1，2，3 h，利用倾注法对不同时间下的菌悬液进行活菌计数，每个样品做3 次平行试验。

2）耐胆盐特性 分别取100 μL 各活化菌液，接种于10 mL 含3 g/L 牛胆盐的无菌YPD 液体培养基中，28 ℃培养0，2，4，6 h，利用倾注法对不同时间下的菌悬液进行活菌计数，每个样品做3 次平行试验。

1.3.3 酵母菌发酵特性初筛 挑取保藏好的酵母菌菌株接种于YPD 液体培养基活化3 代，取第3代活化菌液，并调节菌数到107CFU/mL 用于酵母菌的发酵特性分析试验。

1）耐盐特性 分别取100 μL 各活化菌液接种于10 mL 含0，50，80，100，120，150 g/L NaCl 的无菌YPD 液体培养基中，28 ℃培养24 h，测定菌悬液在波长600 nm 处的OD 值，每个样品做3 次平行试验。

2）产气试验 采用杜氏小管发酵法，将装满YPD 培养基的杜氏小管倒置于装有10 mL YPD液体培养基的试管中，121 ℃灭菌20 min，取灭菌后杜氏小管内无气泡的试管备用。将100 μL 各活化菌液接种于装有杜氏小管的YPD 液体培养基中，28 ℃培养24 h，观察杜氏小管中有无气泡产生及气泡体积，记录菌株的产气情况。

3）产璞试验 分别取100 μL 各活化菌液，接种于10 mL 灭菌麦芽汁液体培养基中，28 ℃培养24 h 后，观察各菌株对应试管表面是否产璞，并记录产璞情况。

4）产醇试验 参照张春芝等[16]方法测定酵母菌的产醇能力。

1.3.4 酵母菌的复筛 取100 μL 调整好菌数的酵母菌菌液，接种于灭菌好的白菜汁中进行发酵，在28 ℃下培养48 h，每个菌株做3 个平行试验，取不接酵母菌的白菜汁作为空白对照，发酵好的菌液保存于4 ℃冰箱内备用。

参照刘春燕[17]描述的方法，测定酵母菌利用还原糖的能力、产氨基态氮能力；参照张鹏[18]描述的方法测定酵母菌产总酯能力。

1.3.5 酵母菌的鉴定

1）形态学鉴定及生理生化试验鉴定 观察单菌落的形态特征，挑取单个酵母菌菌落用亚甲基蓝染色后显微镜镜检观察。

参照《真菌鉴定手册》[19]和《酵母菌的特征与鉴定手册》[20]对复筛得到的优质酵母菌进行糖发酵、氮源同化等生理生化试验，结合形态学鉴定和生理生化试验分析，对菌株进行初步鉴定。

2）26S rDNA 鉴定 将复筛得到的菌株进行活化，按照试剂盒的操作流程提取酵母菌菌株的 总DNA，以ITS1 5’-TCCGTAGGTGAACCT GCGG-3’，ITS4 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ 为扩增引物对菌株DNA 进行PCR 扩增，PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检验[21-22]，PCR 扩增产物送上海派森诺公司进行测序。

1.4 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 酵母菌的分离

从44 种锦州小菜中共分离得到菌株87 株，经菌落形态观察及亚甲基蓝颜色后，用显微镜形态观察，初步鉴定酵母菌的疑似菌株20 株，分别将 其进行编号（JC1、HC1、HC2、LB1、HG1、HG2、HD1、HD2、HD3、QZ1、QZ2、LJ1、LJ2、LJ3、LJ4、SJ1、SJ2、SJ3、SJ4 和SJ5）。

2.2 酵母菌的耐酸、耐胆盐能力比较

2.2.1 耐酸能力 通过比较20 株酵母菌菌株的耐酸能力，检测不同菌株在pH 3 条件下的生长状况，结果见表1。随着培养时间的延长，酵母菌的活菌数出现减少的趋势，其中部分菌株在pH 3条件下培养3 h 后，存活率仍能达到80%以上，说明 这些菌株（HG2、HD1、HD3、LJ1、SJ4、SJ5）具 有较好的耐酸能力。

表1 酵母菌的耐酸能力Table 1 The acid tolerance of yeast

2.2.2 耐胆盐能力 将酵母菌接种于胆盐质量浓度为3 g/L 的培养基中，培养0，2，4，6 h，检测酵母菌的存活状况，比较20 株酵母菌的耐胆盐能力，结果如表2所示。随着培养时间的延长，酵母菌的活菌数出现减少的趋势，其中部分菌株在胆盐质量浓度为3 g/L 条件下培养6 h 后，存活率仍能达到80%以上，说明这些菌株（HC1、LB1、HG2、HD3、LJ1、SJ3、SJ4、SJ5）具有较好的耐胆盐能力。

表2 酵母菌的耐胆盐能力Table 2 The bile salt tolerance of yeast

2.3 酵母菌的初筛

为得到适合作为蔬菜发酵剂的优良酵母菌菌株，选择耐盐、产气、产璞、产醇等指标作为酵母菌的初步筛选指标，将分离的20 株酵母菌利用以下指标进行初筛，选择合适的酵母菌菌株进行下一步试验。

2.3.1 耐盐能力 通过检测酵母菌在不同NaCl质量浓度（0，50，80，100，120，150 g/L）下的生长状况，比较20 株酵母菌的耐盐能力，结果如表3所示。由表可见，大部分菌株可以耐受50 g/L NaCl质量浓度，然而随着NaCl 质量浓度的升高，所有菌株的生长都逐渐变得缓慢，在150 g/L NaCl 条件下，几乎所有菌株都停止生长，在120 g/L NaCl条件下，部分菌株（HC1、HG2、HD3、LJ1、SJ1、SJ4、SJ5）的OD 值在0.6 以上，说明这些菌株仍可以缓慢生长，具有较强的耐盐能力。

表3 酵母菌在不同NaCl 质量浓度下生长的OD600nm 值Table 3 The OD600nm value of yeast in different NaCl mass concentrations

（续表3）

2.3.2 产气、产璞能力 酵母菌在发酵过程中产生气体会破坏发酵蔬菜的质地，从而影响发酵产品的口感。一些酵母菌在发酵过程中还存在产璞现象，产璞会导致发酵制品表面存在一层白膜，不仅会影响产品的外观，而且会使发酵制品产生不良气味，严重影响发酵产品的销售。优良酵母菌应具备不产气、不产璞的特性，本研究检测了20 株酵母菌的产气、产璞情况，结果见表4。由表4可见，部分菌株（HC2、HG2、HD3、LJ1、LJ2、SJ1、SJ4、SJ5）表现出既不产气也不产璞的特性。

表4 酵母菌的产气、产璞能力Table 4 Gas production capacity and calving capacity of yeast

2.3.3 产醇能力 酵母菌能利用发酵基质中的糖分，将其转化成乙醇，赋予发酵制品特殊的醇香风味[23]，同时，乙醇还可以与其它有机酸、醛类等风味物质相互转换，并生成乙酸乙酯等重要的风味物质[24-25]。优良酵母菌发酵剂应具有产醇特性，本研究检测了20 株酵母菌的产醇能力，检测结果如表5所示，大部分菌株都具有产醇能力，然而强弱有所不同，其中部分菌株（HC1、HC2、HG2、HD3、LJ1、LJ3、LJ4、SJ2、SJ4、SJ5）具有较强的产醇能力。

经过耐酸、耐胆盐能力的比较，及耐盐、产气、产璞和产醇等发酵特性的比较，发现菌株HG2、HD3、LJ1、SJ4 和SJ5 具有较好的耐酸耐胆盐能力，同时具有较好的耐盐、不产气、不产璞和产醇等发酵特性，因此选择这5 株酵母菌进行下一步试验。

表5 酵母菌的产醇能力Table 5 Alcohol production ability of yeast

2.4 优良酵母菌的复筛

优质的酵母菌应具有较好的利用糖能力，产风味能力，分解蛋白能力，才能确保其在发酵过程中较好的发挥发酵作用，因此，通过比较酵母菌在发酵前、后的还原糖消耗情况，酯类物质（以乙酸乙酯计）的生成情况，以及氨基酸肽氮的生成情况等指标，对优良酵母菌进行进一步的筛选。

2.4.1 不同酵母菌利用糖的能力 酵母菌在发酵过程中对糖的利用能力是评价酵母菌发酵性能的重要指标之一，其对糖的利用能力越强，说明其在发酵过程中产生的风味物质越多。此外，酵母菌对发酵基质中糖分的利用，也可以抑制发酵制品中其它杂菌的生长繁殖，本研究比较了初筛得到的5 株酵母菌对白菜汁中还原糖的利用情况，结果如图1所示。菌株HD3 表现出了最高还原糖消耗率，为1.46%，其次是SJ4 菌株，也表现出较高的还原糖消耗率，为1.21%，说明这2 株菌具有相对较强的利用发酵基质中糖的能力。

2.4.2 不同酵母菌的产风味能力 酵母菌在发酵过程中产生的风味物质大多是以酯类形式存在，本研究以乙酸乙酯的产生量为指标，比较不同酵母菌的产风味物质能力，结果如图2所示，其中菌株SJ4 表现出产总酯的增加量最高，为4.62 g/100 mL，其次是菌株HD3，其总酯增加量相对较高，为4.01 g/100 mL。

2.4.3 不同酵母菌的分解蛋白能力 酵母菌在发酵过程中能够分解蛋白质产生肽和氨基酸等小分子物质，氨基酸能改善发酵制品的风味，提高其营养价值，本研究通过检测不同酵母菌发酵后白菜汁中氨基酸态氮含量来评估发酵液中氨基酸含量，进一步比较不同酵母菌对蛋白质的分解能力，结果如图3所示，菌株HD3 和菌株SJ4 的发酵液中都检测到较高含量的氨基酸态氮，分别为0.072 g/100 mL 和0.068 g/100 mL。

图1 不同酵母菌菌株消耗还原糖能力Fig.1 The ability of different yeast strains to consume reducing sugar

图2 不同酵母菌产酯增加量Fig.2 Increase in ester production by different yeasts

图3 不同酵母菌发酵液中氨基酸态氮的含量Fig.3 Amino acid nitrogen content in different yeast fermentation broth

通过酵母菌发酵特性复筛试验，综合以上指标，得出HD3 和SJ4 具有较好的利用糖能力、产风味物质能力和分解蛋白能力，因此，对酵母菌HD3 和SJ4 进行形态学、生理生化试验及26S rDNA 鉴定。

2.5 酵母菌的鉴定

2.5.1 形态学观察 酵母菌经纯化后，进一步对其菌落形态及个体形态进行观察，观察结果如表6和图4所示。

表6 形态学观察Table 6 Morphological observation

图4 菌株HD3、SJ4 的菌落形态和细胞形态图Fig.4 Colony morphology and cell morphology of strains HD3 and SJ4

2.5.2 生理生化试验 取纯化后的HD3 和SJ4菌株进行生理生化试验，结果如表7所示，从生理生化试验结果可以看出，2 株酵母菌表现出不同的特征，参照《酵母菌的特征及鉴定手册》和《真菌鉴定手册》，并结合形态学鉴定结果，初步鉴定HD3 为毕赤酵母菌属，SJ4 为孢圆酵母属。

表7 生理生化试验分析Table 7 Analysis of physiological and biochemical tests

2.5.3 26 S rDNA 鉴定结果

1）26S rDNA 扩增结果 以提取出的酵母菌基因组DNA 为模板进行PCR 扩增，扩增后的PCR 产物采用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果表明，这2 株酵母菌菌株的PCR 产物在600 bp 左右均有明显的亮带，说明PCR 扩增成功，可以送出测序。部分代表性酵母菌菌株的PCR 产物检测结果如图5所示。

图5 酵母菌PCR 产物检测电泳图Fig.5 Yeast PCR product detection electropherogram

2）酵母菌26S rDNA D1/D2 区序列同源性比对 将酵母菌HD3 和SJ4 的26S rDNA D1/D2的扩增产物序列结果与NCBI 数据库进行BLAST同源性比对分析（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/），比对结果如表8所示。

由表8可见，菌株HD3 与毕赤酵母菌（Pichia fermentants）的同源性达到100%，菌株SJ4 与戴尔有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）的同源性达到99%。

综上所述，经形态学分析、生理生化试验鉴定，并结合26S rDNA 鉴定，菌株HD3 鉴定为毕赤酵母菌（Pichia fermentants），菌株SJ4 鉴定为戴尔有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）。

表8 酵母菌26S rDNA D1/D2 区序列同源性对比结果Table 8 Comparison of sequence homology of yeast 26S rDNA D1/D2 region

3 结论

发酵制品中主要风味物质来源除自身风味成分之外，其余风味成分主要来源于微生物分解的代谢产物，包括酵母菌发酵基质产生的有机酸、醇类、酯类、氨基酸类等物质[26-27]，这些物质的产生对改善发酵制品的风味至关重要[28]。本研究从44 种辽宁特色锦州小菜中筛选获得的酵母菌菌株HD3和SJ4 表现出良好的发酵特性，同时具有较高的还原糖消耗率、产风味物质能力和分解蛋白质能力，可作为酵母菌发酵剂应用于工业生产，具有进一步研究的价值。