以LDHA 为靶点的抗癌药物虚拟筛选

段超杰，王浩臻，高兵(★通信作者)

（1.沈阳医学院基础医学院，辽宁 沈阳 110034；2.辽宁大学生命科学学院，辽宁 沈阳 110136）

0 引言

癌症是20 世纪最可怕的疾病之一。随着21 世纪癌症发病率的不断增加而进一步蔓延，这种情况非常令人担忧。癌症是一种代谢性疾病[1]，癌细胞与正常细胞相比，主要生化特征之一是即使在低氧条件下也会发生从氧化磷酸化到糖酵解增加的代谢转换，这被称为Warburg 效应[2]。这种对糖酵解的依赖性也使肿瘤缺氧区的细胞具有生长优势。癌症代谢中糖酵解异常增加很大程度上取决于失调的代谢酶。大量研究表明，LDHA 与乳腺癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、神经母细胞癌、口腔鳞状上皮癌、前列腺癌等癌症密切相关[3-9]。LDHA 是在肿瘤细胞的代谢中起关键作用的酶[10-14]，通过将丙酮酸转化为乳酸来促进糖酵解过程,在许多类型的癌症中表达升高，并于肿瘤的生长，维持和侵袭有关[2]。LDHA 的抑制作用会切断癌症的能量和合成代谢效应，从而降低癌细胞的转移和侵袭潜能[15]。因此该酶被认为是新的抗癌药物的潜在靶标。

LDHA 是乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)家族中的一员，是由LDH-A 基因编码的M 亚基组成的四聚体酶，并要与NADH 结合后才可发挥生物学活性。NADH 依赖酶LDHA 介导了当胞浆NADH/烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+) 比率较高时，催化丙酮酸还原为乳酸的氧化还原反应，这是再生NAD+的关键步骤，并且需要维持糖酵解以延续癌细胞的存活[16-18]。目前研究发现，一些MicroRNA可通过直接与其3’非翻译区(3’UTR)结合来抑制LDHA mRNA 表达水平，从而阻碍糖酵解，细胞增殖和侵袭[6,19,20]。除此之外，一些天然化合物被报道对LDHA 活性也存在抑制作用，包括Stiripentol[21]，Machilin A[22]，天然产物棉酚[23]，N-羟基吲哚[15]，衍生物FX-11[24]，它们其中大部分都是通过阻断LDHA 的NADH 结合位点而成为竞争性抑制剂，可抑制各种癌细胞中的LDHA 活性。

计算机虚拟筛选(Virtual Screening)是药物开发的重要手段之一,被广泛应用于现代药物前期开发。其中分子对接(Molecular Docking)是在经过综合计算后，预测受体分子和配体分子间的结合方式和结合能力。虚拟筛选依赖有效的药物靶点和丰富的化合物数据库。在药物开发过程中虚拟筛选使用的化合物通常是尽可能涵盖所有可及的化合物，但该研究的主要目的是寻找具有潜在医疗价值的天然产物，所以将只使用天然产物数据库。Drug Bank数据库是一个独特的生物信息学和化学信息学资源库，它将详细的药物数据与全面的药物靶点信息结合到一起，为我们提供了丰富的天然产物的资源。

本研究旨在以LDHA 的NADH 结合区为靶点，运用计算机虚拟筛选技术，筛选出一批有效的天然产物，为癌症救治提供线索。

1 材料与方法

1.1 实验材料

蛋白质晶体结构来自PDB 数据库(RCSB Protein Date Bank)；天然产物结构来自Drug Bank 数据库；Auto Dock Tools，Auto Dock Vina 分子对接软件，PyMol 分子三维结构显示软件，深度学习GPU 静音服务器。

1.2 靶蛋白处理

在蛋白质数据库网站RCSB 下载人类LDHA 酶的三维结构数据，PDB ID:1I10。用PyMol 与Auto Dock Tools 进行处理，除去多余的分子，将其格式转换为Pdbqt 格式。最后以NADH 结合区作为对接口袋，利用Grid box 程序生成对接口袋格点文件。

1.3 小分子配体库的建立

所有化合物的三维结构从Drug Bank 数据库进行下载，共计7877 种。

1.4 小分子配体库与受体蛋白的分子对接

将获取到的所有文件都存放在深度学习GPU 静音服务器中。以小分子配体为分子探针，根据生成的对接口袋格点文件对处理后的LDHA 受体进行Auto Dock Vina 虚拟筛选。根据对接结果给出的结合能由小到大排序，提取并过滤出活性最佳的化合物。NADH 是LDHA 酶的辅因子，两者结合后才可发挥生物学活性。选择NADH 与LDHA 的结合位点作为对接口袋进行虚拟筛选。对接口袋设置为：center(x,y,z)=(19.875,54.312,173.081)，size(x,y,z)=(30,24,22)。

2 结果

2.1 LDHA 晶体结构

LDHA 的三维晶体结构(PDB ID:1I10)从蛋白质数据库(PDB)下载。用PyMol 去除多余的配体，再用Auto Dock Tools 删除水分子，加电荷，加氢原子等处理，然后转换为Pdbqt 格式。经处理后的LDHA 的晶体结构见图1。

图1 LDHA 的晶体结构

2.2 天然产物的对接结果

经过Auto Dock vina 首轮的虚拟筛选从7877个化合物中得到了74 个结合能小于-10.0 的化合物。之后，用Auto Dock 对接软件在74 个化合物中复筛，得到最佳的5 个化合物（表1），包括2'-deoxy-N-(naphthalen-1-ylmethyl) guanosine 5'-(dihydrogen phosphate),MGB-BP-3,Naldemedine,RU85053,2-[4-[(Z)-2-Acetamido-3-oxo-3-[[(3S)-2-oxo-1-[(4-phenylphenyl)methyl]azepan-3-yl]amino]prop-1-enyl]-2-formylphenyl]acetic acid。并将这5 个化合物作进一步分析，化合物结构见图2。

表1 候选小分子的打分值

2.3 中靶化合物与LDHA 的相互作用模型

针对中靶化合物进行了进一步的分析，得到了5 个化合物与LDHA 的相互作用模型，结果显示5 个分子均准确地对接到LDHA 的NADH 结合区，并与周围的等氨基酸形成相互作用，影响了NADH 与ALA29,VAL30,ASP51,ALA97 等氨基酸残基的疏水作用以及与ARG98,ASN137,HIS192,THR247 等氨基酸残基的氢键结合（图3）。

图2 候选化合物的结构

3 讨论

LDHA 是机体内一个重要的脱氢酶，与NADH 结合后参与许多重要的生物学过程。在人体组织中有5种活性LDH 同工酶，每一种都是由M 和H 两个主要亚基组成的四聚体酶，分别由LDH-A 和LDH-B 编码。骨骼肌以M 亚单位为主，心肌以H 亚单位为主。当A链多于B 链时，LDH 同工酶在催化丙酮酸转化为乳酸方面变得更为有效；相反，B 链的过量有利于丙酮酸进入柠檬酸循环转化为乙酰辅酶A[2]。在正常生理条件下，丙酮酸由葡萄糖通过糖酵解生成，并在线粒体中进入柠檬酸循环形成乙酰辅酶A，用于促进氧化磷酸化。然而，当氧气缺乏时，细胞无法利用氧化磷酸化有效地产生ATP。在这种情况下，糖酵解成为ATP 的主要来源。与正常细胞相比，癌细胞的糖酵解速率增加。LDHA 在调节糖酵解中起着关键的作用，它的上调有助于提高肿瘤细胞厌氧糖酵解的效率，降低它们对氧的依赖性，以产生足够的能量来满足快速增殖的肿瘤细胞的需求。因此，以LDHA 为靶点，设计研发特异性的LDHA 抑制剂可为癌症的治疗提供新的思路和潜在药物。目前已经发现LDHA 抑制剂也在癫痫[25]，肾草酸钙结石[26]等疾病的防治也具有重要作用。虚拟筛选技术是进行创新药物研究的新技术，由于其高效、快速、经济等优势，近年来已经成为一种与高通量筛选互补的药物筛选技术。目前，虚拟筛选技术已经用于LDHA 抑制剂的研发[27-29]。

本研究以LDHA 的NADH 结合区为靶点,利用Auto Dock Vina 对接软件对Drug Bank 数据库7877个化合物进行虚拟筛选，发现了5 个新的高活性LDHA 抑制剂。通过数据库查询我们发现中靶化合物MGB-BP-3 与Naldemedine 的药理学信息。其中，MGB-BP-3正在进行治疗艰难梭菌感染的临床试验当中。Naldemedine是一种类鸦片受体拮抗剂，可以拮抗阿片类药物的便秘作用，于2017年在美国和日本被批准用于治疗阿片类药物引起的便秘。笔者的筛选结果可为新的LDHA抑制剂的研发提供有用的信息。随着虚拟筛选工具的不断改进，LDHA抑制剂的研发速度必定会大大提高。通过虚拟筛选设计小的类药物分子来靶向LDHA是可以实现的，并且能够阻碍肿瘤的生长和维持。然而，虚拟筛选技术仅仅是创新药物研究的辅助性工具，仅仅考虑受体配体的相互作用，而未考虑药物复杂的作用机制以及可能存在的毒性作用等问题，所以许多中靶化合物仍然需要进一步的发展来提高其特异性和效力。因此，本研究通过虚拟筛选发现的5个高活性的LDHA抑制剂有待进一步通过实验验证其药理活性及毒性。