Ang-1 基因转染至BMSCs 后对高氧诱导的新生鼠视神经损伤模型的协同保护作用

陈迁 任建兵 黎红平 王柱 任竹潇 甘嘉敏 向建文 聂川

BMSCs 是骨髓中一种具有多向分化能力的干细胞,是骨髓造血微环境的关键组分,其在体外环境中的增殖能力很强,而免疫应答的性能较弱,可以保持原代细胞的遗传稳定,尤其是在组织受损的情况下,采用BMSCs 治疗可以修复受损的组织,同时在受损的组织旁分泌血管生成因子、营养因子,以改善血管生成的微环境,促进血管新生［1-3］。Ang-1 以存在血管内皮细胞中为主,在血管生成素受体酪氨酸激酶2(Tie-2)受体的诱导下可以促进血管生成和组织修复等［4,5］。其在缺血和缺氧的环境中具有较强的耐受性,是促血管生成素的一种类型,可以促进血管成熟,诱导血管内皮细胞趋化,抑制血管内皮细胞凋亡等［6］。本研究通过高氧诱导视神经损伤小鼠,给小鼠注射Ang-1 基因转染至BMSCs,观察Ang-1 基因转染至BMSCs 后对高氧诱导的新生鼠视神经损伤模型的协同保护作用报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 选择30 只出生后3 d 的健康小鼠,母鼠同笼,均购自常州卡文斯实验动物有限公司。幼鼠体重5～20 g,置于安静、室温和湿度适宜的环境下进行饲养。造模期间可自由摄食和饮水。将30 只小鼠随机分为高氧盐水组、空白对照组、Ang-1 基因转染至BMSCs 后注射高氧盐水组(Ang-1+BMSCs 高氧组),每组10 只。

1.2 方法 高氧盐水组和Ang-1+BMSCs 高氧组小鼠在高浓度氧环境下共饲养5 d,严密关注是否有死亡的小鼠。待鼠龄12 d 将上述两组小鼠移至空气中,与空白对照组一同饲养直至鼠龄17 d,观察三组小鼠的一般情况、活动能力、体重。其中Ang-1+BMSCs 高氧组在鼠龄第6 天、第10 天、第14 天分别于显微镜下向玻璃体内注射转染Ang-1 基因的BMSCs 细胞(0.1 ml/只),内含细胞数平均为 1×106/0.1 ml,空白对照组和高氧盐水组在鼠龄第6 天、第10 天、第14 天分别注射同等剂量的9%氯化钠溶液。

从液氮储罐中取出BMSCs 菌株,将其置于37.0℃的温水中。缓慢摇晃装有BMSC 的橡胶手套,直到BMSC 逐渐融化为液体。然后将装有BMSC 的冷冻管放在测试台上,通风,将BMSCs 悬浮液转移至离心管中,加入细胞培养基,缓慢吸移使其完全混合,1000 r/min,离心5 min；用移液管弃去上清液,加入含血清的培养基,用移液管吸移,在显微镜下观察细胞形态。细胞复苏后,将复苏的细胞接种到培养瓶中,观察1 d 后细胞融合程度,更换细胞培养基,在显微镜下观察细胞状态。细胞贴壁超过80%时,进行亚培养；去除旧培养基,添加PBS 缓冲液冲洗培养瓶,弃去PBS 缓冲液,冲洗3 次,用胰蛋白酶消化,摇动培养瓶,让胰酶充分接触细胞,将其置于37.0℃的培养箱中,并进行培养,当其处于絮凝状态,细胞会缩回,则培养完成。该过程在超净工作台上进行；在显微镜下观察贴壁细胞的缩回状态。细胞和细胞之间的空间变大,并且细胞呈球状,当少量细胞脱离壁时,应立即终止消化。用移液器轻轻吹动瓶壁,使细胞与瓶壁分离,形成单细胞悬液。在显微镜下观察瓶壁,细胞几乎完全脱落后,将细胞悬液转移至离心管中,1000 r/min,离心5 min,除去上清液,加入适量的培养基,用玻璃移液管吹动细胞,在显微镜下观察并记录细胞数量。以1∶2 的速率亚培养细胞数,观察培养基的颜色,并根据细胞的粘附性每天更换一次培养基；每天在显微镜下观察并记录亚培养的情况。

观察每组小鼠的发育情况,在18 d 时从每组小鼠中获取视神经组织,行苏木精-伊红染色法(HE)和固蓝染色(FASTBLUE,LFB)、免疫荧光检测、免疫组化染色及透射电子显微镜观察。

1.3 观察指标 比较三组小鼠有髓神经纤维数目、直径、轴索直径及髓鞘厚度。

1.4 统计学方法 采用SPSS22.0 统计学软件对研究数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差()表示,三组比较采用方差检验。P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

空白对照组、Ang-1+BMSCs 高氧组轴索直径显著长于高氧盐水组,差异具有统计学意义(P<0.05)；三组轴索直径比较差异具有统计学意义(P<0.05)。空白对照组、Ang-1+BMSCs 高氧组有髓神经纤维直径长于高氧盐水组,差异具有统计学意义(P<0.05)；三组有髓神经纤维直径比较差异具有统计学意义(P<0.05)。高氧盐水组、Ang-1+BMSCs 高氧组有髓神经纤维数目低于空白对照组,Ang-1+BMSCs 高氧组神经纤维数量明显高于高氧盐水组,差异具有统计学意义(P<0.05)；三组有髓神经纤维数量比较差异具有统计学意义(P<0.05)。空白对照组、Ang-1+BMSCs 高氧组髓鞘厚度大于高氧盐水组,差异具有统计学意义(P<0.05)；三组髓鞘厚度比较差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 三组小鼠有髓神经纤维数目、直径、轴索直径及髓鞘厚度比较()

表1 三组小鼠有髓神经纤维数目、直径、轴索直径及髓鞘厚度比较()

注：三组比较,P<0.05

3 讨论

用透射电镜观察各组的视神经,高氧盐水组视神经纤维的髓鞘清晰可见,轴索与髓鞘之间有缝隙,可见髓鞘板层状分离,轴索水肿,线粒体肿胀,轴索中的微丝溶解,微管丢失,并形成液泡。有髓神经纤维的直径和数量减小,而无髓神经纤维的数量增多。空白对照组,高氧盐水组和Ang-1+BMSCs 高氧组分别进行形态学定量分析,空白对照组和Ang-1+BMSCs 高氧组的有髓神经纤维直径和轴索直径长于高氧盐水组,Ang-1+BMSCs 高氧组、空白对照组有髓神经纤维数目和髓鞘厚度明显大于高氧盐水组,差异具有统计学意义(P<0.05),这表明Ang-1 基因转染BMSCs 可帮助恢复高氧诱导所致视神经损伤的超微结构。本研究将Ang-1基因转染至 BMSCs 中,观察Ang-1 基因和BMSCs 对高氧诱导所致视神经损伤的协同保护作用,研究结果表明,Ang-1 基因转染BMSCs 可能对高氧诱导新生小鼠的视神经损伤有一定的保护作用,表明干细胞治疗是一种具有发展前景的视神经损伤治疗方式。

高氧诱导的新生小鼠视神经损伤会自发性退缩,因此不可能进行长期研究,并且,Ang-1 能否保持长效,各研究者存在意见分歧,此外,Ang-1 的用药方法、用药剂量以及使用后是否会对角膜、晶状体等产生毒副反应仍不确定,需进行深入的研究以证实［6］。本研究选取的BMSCs 免疫应答性能较弱,其分化能力相比胚胎干细胞较弱,同时我国对于干细胞研究缺少相应的法律制度,导致当前关于干细胞的研究监管力度不大,科学性和合理性较低,仅停留于动物阶段。当前我国出现的研究大多是关于BMSCs 对视神经的保护作用,很多研究仍在持续进行,并且部分实验已经完成,大部分研究是关于视网膜神经节和轴突生长方面的研究［7］。另外,以后的研究可能需对视觉功能进行分析以探讨干细胞的作用机制,对于制定安全性和有效性均较高的治疗方法意义重大。不可否认的是,这是一个艰巨而持久的任务,并且需在显微领域以及免疫领域都获得进步。

综上所述,高氧诱导新生鼠视神经损伤后将Ang-1 基因转染到BMSCs 中可以明显改善受损视神经的超微结构。但是,视神经损伤的长期作用及其机制尚需深入研究。