酵母β-葡聚糖水解酶的表达及应用

周 星， 王 丽， 堵国成，2， 康 振*，2

（1. 江南大学 生物工程学院，江苏 无锡214122；2. 江南大学 糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡214122）

酵母β-葡聚糖是存在于酵母细胞壁中的一种多糖，占细胞壁干质量的40%～60%[1]。 酵母β-葡聚糖是以β-1，3-葡聚糖为主，β-1，6-葡聚糖为辅的一种混合多糖，其中85%左右为水不溶性。 研究表明， 酵母β-葡聚糖是一种良好的生物效应应答剂，具有增强免疫力、激活免疫细胞、抗肿瘤、抗感染等功能[2]。此外，酵母β-葡聚糖还可以抗氧化、抗辐射、降低胆固醇和血脂。 因此，酵母β-葡聚糖已广泛应用于医疗、保健食品和化妆品行业中[3-5]。

酵母β-葡聚糖通过分子间氢键的相互作用，形成致密的三股螺旋结构而不溶于水，水不溶性不仅制约了酵母β-葡聚糖的应用范围，也会影响其生物活性的发挥[6]。为了提高酵母β-葡聚糖的水溶性，国内外学者对其进行了修饰和改性研究，主要方法有化学方法、物理方法和生物方法。 物理方法主要有超声波法[7]、辐照法[8]和机械活化法[9]；化学方法有羧甲基化[10]、硫酸酯化[11]和磷酸酯化[12]；生物方法主要是酶法。酶法増溶改性是通过β-葡聚糖酶将大分子酵母β-葡聚糖酶解成小分子葡聚糖，从而增加酵母β-葡聚糖的水溶性，水解过程条件温和，不会破坏酵母β-葡聚糖的结构，对其生物活性影响较小。 目前， 用于生物法对酵母葡聚糖改性增溶的酶种类少，价格昂贵[13]。 本研究中，作者在大肠杆菌中异源表达两种不同的酵母β-葡聚糖水解酶， 分别是β-1，3-葡聚糖水解酶Gly5m[14]和β-1，6-葡聚糖水解酶BT3312[15]。 Gly5m 来源于Saccharophagus degradans 2-40T ， 对于β-1，3-葡聚糖具有内切水解作用。BT3312 来源于Bacteroides thetaiotaomicron， 对β-1，6-葡聚糖具有内切水解作用。 通过两种不同的酵母β-葡聚糖的水解作用， 可以降低酵母β-葡聚糖的相对分子质量，增加其在水中的溶解率。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 E. coli （大肠杆菌） JM109：用于构建和增殖重组质粒，作者所在实验室保存；E. coli（大肠杆菌）BL21：表达宿主，作者所在实验室保存；质粒pET-28a（+）（Kan+，T7 启动子）：作者所在实验室保存。

1.1.2 酶、引物、DNA marke 及相关试剂盒 Primer STAR DNA 聚合酶、 DNA marker、T4 DNA 连接酶和大肠杆菌感受态细胞制备盒：均购自TaKaRa（大连）；各种限制性内切酶：购自Thermo 公司；PCR 引物：由生工生物（上海）有限公司合成，见表1；质粒小量抽提试剂盒：购自生工生物（上海） 有限公司；酵母葡聚糖：购自安琪酵母公司。

表1 PCR 扩增引物Table 1 Primers for PCR amplification

1.1.3 培养基 LB 培养基（组分g/L）：蛋白胨10，氯化钠10，酵母粉5；自然pH。 制备固体培养基时添加2 g/dL 的琼脂。

TB 培养基（组分g/L）：蛋白胨12，酵母提取物24，KH2PO42.31，K2HPO412.54；甘油4 mL。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的获得

1）gly5m 的 获 得： 根 据GenBank 噬 菌 体 的gly5m 基因（基因收录号：ABD82280.1）由南京金斯瑞生物科技有限公司进行全基因合成。

2）bt3312 的获得：根据GenBank 多形拟杆菌的bt3312 基因（基因收录号：AE015928.1）由南京金斯瑞生物科技有限公司进行全基因合成。

1.2.2 重组载体的构建

1）pET-28a（+）-gly5m 的构建：设计引物F1 和R1，以合成的gly5m 为模板PCR 扩增得到上游带有BamH I 酶切位点和下游带有Xho I 酶切位点的gly5m 产物。用BamH I 和Xho I 对PCR 产物和质粒pET-28a（+）进行酶切后，用T4 DNA 连接酶进行过夜连接，转化E. coli JM109 感受态，挑取转化子测序，测序正确即获得重组质粒pET-28a（+）-gly5m，见图1。

2）pET-28a（+）-bt3312 的构建：设计引物F2 和R2， 以合成的bt3312 为模板PCR 扩增得到上游带有BamH I 酶切位点和下游带有Xho I 酶切位点的bt3312 产物。 用BamH I 和Xho I 对PCR 产物和质粒pET-28a（+）进行酶切后，用T4 DNA 连接酶进行过夜连接，转化E. coli JM109 感受态细胞，挑取转化子测序，测序正确即获得重组质粒pET-28a（+）-bt3312，见图1。

图1 重组质粒p ET-28a（+）-gly5m 和pET28a（+）-bt3312构建过程图Fig. 1 Schematic of plasid construction pET-28a（+）-gly5m and pET28a（+）-bt3312

1.2.3 重组载体的转化与诱导表达 挑取测序正确的重组质粒转化E.coli BL21（DE3），挑取单菌落接种于装有3 mL LB 液体培养基 （含有50 μg/mL氨苄青霉素或卡那霉素）的12 mL 摇菌管中，37 ℃、220 r/min 过夜培养。 种子液按2%接种体积分数转接至含50 mL TB （含有50 μg/mL 氨苄青霉素或卡那霉素）的250 mL 三角瓶中，37 ℃、220 r/min 培养至OD600＝0.6～0.8，添加终浓度为0.2 mmol/L 的IPTG诱导，诱导表达12 h，收集菌体。

1.2.4 重组β-葡聚糖水解酶的酶活测定 发酵液于7 000 r/min 离心10 min，分离得到上清液即胞外粗酶液。 收集菌体，用质量分数0.9%的生理盐水洗涤，20 mmol/L PBS 缓冲液（pH 7.5）重悬菌体，稀释至合适的浓度，超声破碎。13 000 r/min 离心30 min，分离得到破碎上清液， 即胞内粗酶液。 底物配制：20 mmol/L PBS 缓冲液 （pH 7.5），10 mg/mL 的酵母葡聚糖。990 μL 底物加10 μL 适当稀释的粗酶液于37 ℃水浴保温30 min，DNS 法测还原糖质量浓度。

1.2.5 重组β-葡聚糖水解酶水解产物HPLC 分析水解条件：20 mmol/L PBS 缓冲液（pH 7.5），酵母葡聚糖4 g/L，酶活10 U/mL。 设置3 个实验组：第一组只添加β-1，3-葡聚糖水解酶Gly5m；第二组只添加β-1，6-葡聚糖水解酶BT3312； 第三组同时添加等酶活的β-1，3-葡聚糖水解酶Gly5m 和β-1，6-葡聚糖水解酶BT3312。 37 ℃下反应12 h，取样分析。 水解样品使用孔径0.22 μL 的滤膜过滤后， 采用高效体积排阻色谱和多角度激光散射联用进行相对分子质量测定。 采用UltrahydrogelTM色谱柱（300 mm×7.8 mm，美国沃特斯公司）、多角度激光散射检测器（美国怀雅特公司）检测和示差折光检测器（美国怀雅特公司）检测。 条件：0.1 mol/L NaNO3溶液作为流动相，流速恒定保持在0.6 mL/min，柱温保持在40 ℃，进样量为10 μL。

1.2.6 重组β-葡聚糖水解酶产物溶解率测定 水解条件：20 mmol/L PBS 缓冲液（pH 7.5），酵母葡聚糖25 g/L，酶活200 U/mL。 设置3 个实验组：第一组只添加β-1，3-葡聚糖水解酶Gly5m；第二组只添加β-1，6-葡聚糖水解酶BT3312； 第三组同时添加等酶活的β-1，3-葡聚糖水解酶Gly5m 和β-1，6-葡聚糖水解酶BT3312。 37 ℃反应12 h，定时取样。 样品于12 000 r/min 离心10 min， 用蒽酮法测定上清液中的总糖质量浓度。

2 结果与分析

2.1 目的基因的扩增和重组载体的构建

2.1.1 pET-28a （+）-gly5m 的 构 建 以 合 成 的gly5m 为模板，引物F1 和R1 进行PCR 扩增，扩增得到大约2 700 bp 的片段，见图2（a）。

采用DNA 纯化回收试剂盒对单一凝胶片段进行回收，回收后的gly5m 片段与用BamH I 和Xho I酶切后得到的线性质粒pET-28a （+）-gly5m 连接，转化 E. coli JM109， 挑取转化子交由上海生工生物工程有限公司测序， 测序结果正确， 重组载体pET-28a（+）-gly5m 构建成功。

2.1.2 pET-28a （+）-bt3312 的构建 以合成的bt3312 为模板，引物F2 和R2 进行PCR 扩增，扩增得到大约1 600 bp 的片段，见图2（b）。采用DNA 纯化回收试剂盒对单一凝胶片段进行回收，回收后的bt3312 片段与用BamH I 和Xho I 酶切后得到的线性质粒pET-28a （+）-bt3312 连接， 转化E. coli JM109， 挑取转化子交由上海生工生物工程有限公司测序， 测序结果正确， 重组载体pET-28a （+）-bt3312 构建成功。

图2 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳分析Fig. 2 Analysis of PCR products by agarose gel electrophoresis

2.2 诱导温度对重组β-葡聚糖水解酶的影响

2.2.1 诱导温度对Gly5m 的影响 将重组菌E. coli BL21（DE3）-pET-28a（+）-gly5m 分 别 在20、25、30 ℃下诱导12 h，离心得到胞外粗酶液，菌体超声破碎后得到胞内粗酶液，结果见图3（a）。 重组菌分别在20、25、30 ℃下诱导12 h 后，所得重组β-葡聚糖水解酶Gly5m 总酶活分别为605、707、559 U/mL。结果表明，温度对重组β-葡聚糖水解酶Gly5m 的酶活影响较小。 另外， 重组菌在30 ℃诱导12 h 后，Gly5m 都分泌到胞外， 细胞破碎上清液无酶活；在20、25 ℃诱导12 h 后，细胞破碎上清液中还存在少量重组β-葡聚糖水解酶。

2.2.2 诱导温度对BT3312 的影响 将重组菌E.coli BL21（DE3）-pET-28a（+）-gly5m 分别 在20、25、30 ℃下诱导12 h 后，离心得到胞外粗酶液，菌体超声破碎后得到胞内粗酶液，结果见图3（b）。 重组菌在30、25、20 ℃下诱导12 h 后，所得重组β-葡聚糖水解酶BT3312 总酶活分别为1 652、1 896、1 888 U/mL，25 ℃诱导时酶活最高。 另外，重组菌在20 ℃诱导时，BT3312 胞内酶活最高。结果表明，温度不仅影响BT3312 的酶活，同时也会影响BT3312 向胞外分泌。

图3 不同诱导温度对Gly5m 和BT3312 酶活的影响Fig. 3 Effects of different induction temperatures on the enzyme activity of Gly5m and BT3312

2.3 诱导时间对重组β-葡聚糖水解酶的影响

2.3.1 诱导时间对Gly5m 的影响 由2.2.1 可知，重组菌E. coli BL21（DE3）- pET-28a（+）-gly5m 在25 ℃诱导时酶活最高， 故将重组菌在25 ℃分别诱导4、6、8、10 h。 离心得到胞外粗酶液，菌体超声破碎后得到胞内粗酶液，结果见图4（a）。 重组菌在25 ℃诱导4 h 后，重组β-葡聚糖水解酶Gly5m 总酶活达到最高，为1 086 U/mL，且此时胞外酶活也达到最高，为888 U/mL。 此外，重组菌在诱导时间超过4 h后，总酶活开始下降，说明Gly5m 不稳定，开始降解。

2.3.2 诱导时间对BT3312 的影响 由2.2.2 可知，重组菌E. coli BL21（DE3）- pET-28a（+）-bt3312 在25 ℃诱导时酶活最高， 故将重组菌在25 ℃分别诱导4、6、8、10 h。 离心得到胞外粗酶液，菌体超声破碎后得到胞内粗酶液，结果见图4（b）。 重组菌在30 ℃诱导8 h 后，总酶活达到最高，为2 355 U/mL，且此时胞内、胞外酶活均达到最高，分别为917、1 438 U/mL。 此外，重组菌在诱导时间超过8 h 后，酶活开始下降，说明BT3312 也不稳定。

图4 不同诱导时间对Gly5m 和BT3312 酶活的影响Fig. 4 Effects of different induction time on the enzyme activity of Gly5m and BT3312

2.4 重组β-葡聚糖水解酶的水解产物HPLC 分析

以未经重组β-葡聚糖水解酶水解的酵母葡聚糖为对照，对3 个实验组水解产物进行HPLC 分析，结果见图5。 两种重组酶都有水解酵母葡聚糖的能力，且两种重组酶可以同时添加共同发挥作用。 比较3 种水解方式所得产物发现，经BT3312 水解后，所得产物相对分子质量最大， 推测原因可能是BT3312 专一性水解β-1，6-糖苷键，而在酵母β-葡聚糖中，β-1，6-葡聚糖少，占10%～15%[16]，因此通过BT3312 水解后， 所得产物中大部分的β-葡聚糖没有水解，故相对分子质量大。 反之，Gly5m 主要水解β-1，3-糖苷键，在酵母β-葡聚糖中，β-1，3-葡聚糖多，故经Gly5m 水解后，所得产物相对分子质量更小。 此外，当BT3312 和Gly5m 共同水解时，水解最彻底，剩余的底物最少，推测原因是酵母β-葡聚糖中同时含有β-1，3-糖苷键和β-1，6-糖苷键，而β-1，6-糖苷键的存在可能会影响β-1，3-葡聚糖水解酶Gly5m 发挥作用， 故当β-1，6-葡聚糖水解酶BT3312 水解掉β-1，6-糖苷键后，Gly5m 才能更好地发挥水解作用，使水解更加彻底。

图5 Gly5m 和BT3312 水解酵母β-葡聚糖的产物分析Fig. 5 Analysis of yeast β-glucan hydrolyzed by Gly5m and BT3312

2.5 重组β-葡聚糖水解酶水解产物的溶解率

酵母β-葡聚糖经过Gly5m 和BT3312 单独或共同水解后，溶解率均有增加，结果见图6。 添加相同酶量水解时，同时添加Gly5m 和BT3312，水解产物溶解率增加量最多，从12%增加到50%，水溶性酵母葡聚糖质量浓度为12.5 g/L。 当Gly5m 和BT3312 共同水解时，酵母葡聚糖水解最彻底，前后结果一致。 当只用Gly5m 水解时，酵母葡聚糖溶解率提高了2.6 倍， 水溶性酵母葡聚糖质量浓度为11 g/L；当只用BT3312 水解时，酵母葡聚糖溶解率提高了2.4 倍， 水溶性酵母葡聚糖质量浓度为10.25 g/L。

3 结 语

酵母β-葡聚糖广泛应用于医疗、保健食品和化妆品行业中，但因为其水不溶性，限制了它的应用。作者在E. coli 中表达了两种不同的酵母β-葡聚糖水解酶， 两种酶不仅都有水解酵母β-葡聚糖的能力， 而且可以同时发挥作用。 通过两种不同的酵母β-葡聚糖水解酶的水解作用，使得酵母β-葡聚糖溶解性增加，且结构和活性不被破坏。 但是，两种水解酶在E. coli 中表达量低，SDS-PAGE 检测分析中没有明显条带，为进一步提高表达量和酶活，可通过优化培养基、培养条件、构建不同启动子的表达系统等进行尝试表达。 此外，作者对两种酵母β-葡聚糖水解酶共同水解酵母葡聚糖以提高其水溶性只进行了初步探索，为进一步提高水解效率，可以优化水解条件、添加的酶活浓度以及两种水解酶的比例。

图6 Gly5m 和BT3312 水解酵母β-葡聚糖产物溶解率Fig. 6 Water-solubility of yeast β-glucan hydrolyzed by Gly5m and BT3312