乳酸菌或有机酸盐与尿素复配添加对紫花苜蓿混合青贮的影响

谢展 ，穆麟 ，张志飞 *，陈桂华 ，刘洋 ，高帅 ，魏仲珊

（1. 湖南农业大学农学院，湖南 长沙 410128；2. 湖南德人牧业科技有限公司，湖南 常德 415921）

紫花苜蓿（Medicago sativa）是世界上广泛种植的多年生优质豆科牧草，营养价值高，适口性好，有“牧草之王”的美誉。随着畜牧业的快速发展，近年来紫花苜蓿在我国南方也被广泛推广［1］，而南方气候多变，苜蓿收获期常遇雨季，干草晒制较为困难。罗颖洁等［2］表明利用新鲜紫花苜蓿与不同比例的水稻秸秆和麦麸进行混合青贮，可解决紫花苜蓿雨季安全贮藏的问题，同时可促进水稻秸秆饲料化，提高秸秆利用率，但水稻秸秆粗纤维含量较高，随着水稻秸秆添加量增加，混合青贮的营养品质下降。而青贮添加剂的使用是提高青贮发酵品质和营养品质的有效途径［3］。

青贮促进型添加剂乳酸菌有利于青贮料快速进入乳酸菌发酵阶段，降低青贮料pH 值，抑制有氧发酵菌的生长，达到保存青贮料营养物质的目的［3］；青贮抑制型添加剂有机酸（盐）能够快速降低青贮料的pH 值，抑制青贮初期有害微生物的繁殖，减少青贮料发酵初期营养物质的损失，从而保证有更多的营养物质供乳酸菌繁殖利用产生有机酸，达到保存更多青绿饲草营养物质的目的［3−4］；青贮营养型添加剂尿素作为一种非蛋白氮，可增加青贮饲料中的粗蛋白质含量［5］，还可使青贮料的有氧稳定性延长［6］。全株玉米（Zea mays）青贮中复合添加乳酸菌和尿素能提高青贮料的乳酸和氨态氮含量，防止pH 值过分降低，提高粗蛋白质含量［7］；玉米青贮中添加丙酸和尿素效果也优于单独添加效果［8］；皇竹草（Pennisetum sinese）青贮中复合添加乙酸和尿素亦有利于提高青贮的营养品质［9］。基于此可知，乳酸菌、有机酸与适量的尿素在青贮过程中可起到复配增效的作用。本研究以80%新鲜紫花苜蓿+10%水稻秸秆+10%麦麸（质量比）为青贮原料，探讨乳酸菌或有机酸与不同比例尿素复配添加对混合青贮料发酵品质、营养品质和有氧稳定性的影响，比较紫花苜蓿混合青贮料中乳酸菌与有机酸和尿素复配的青贮效果，筛选适宜的添加剂组合。

1 材料与方法

1.1 试验材料

紫花苜蓿种植于湖南省常德市西湖管理区试验地（海拔 32 m，112°03′46″E，29°07′04″N），2018 年 9 月 26 日第5 茬现蕾期刈割，粉碎至1～2 cm 待用。收获当年的风干水稻秸秆粉碎至2～3 cm 待用。麦麸购自邯郸市锐马面业有限公司。青贮材料化学成分见表1。

表1 青贮原料化学成分Table 1 Chemical composition of ensilage materials

乳酸菌剂购自台湾亚芯生物科技有限公司，含植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）及其他乳酸菌类，活菌数为1.0×1011cfu·g−1。有机酸盐购自四川爱客信生物科技股份有限公司，含丙酸≥20%，丙酸铵≥15%，铅≤10 mg·kg−1，砷≤2 mg·kg−1。尿素购自湖北省三宁化工股份有限公司，总氮＞46.5%。

1.2 试验设计

本试验采用双因素试验设计，因素A 为菌酸添加剂，设2 个水平：乳酸菌（lactic acid，LA）剂组，添加量2 g·t−1FW 和有机酸盐（organic acid salt，AS）组添加量 1 g·kg−1FW；因素 B 为尿素添加量，设 4 个水平，添加量分别为 0（U0）、1.5（U1）、3.0（U2）和 4.5（U3）g·kg−1FW。共 8 个处理组，每处理组 6 次重复。

新鲜紫花苜蓿、水稻秸秆和麦麸的质量比例为8∶1∶1。首先将不同添加比例的尿素溶解于少量水中分别均匀喷洒在水稻秸秆上，再将乳酸菌或有机酸盐均匀喷洒新鲜紫花苜蓿，然后二者与麦麸混合均匀；使用聚乙烯包装袋真空包装，每袋600 g。避光室温（25 ℃）保存45 d 后，开包取样测定各项指标。

1.3 指标与测定方法

开包后取20 g 青贮料装入榨汁机（九阳JYL-C012 型多功能搅拌机），加入180 mL 去离子水，运行2 min，用2层无菌纱布过滤，再用定性滤纸进行过滤，得到青贮饲料浸提液，用于pH 值、乳酸（LA）、乙酸（acetic acid，AA）、丙酸（propionic acid，PA）、丁酸（butyric acid，BA）和氨态氮（ammonia-N，NH3-N）含量的测定，各指标3 次重复。pH 值采用Spectrum 公司SI400 型pH 计测定；乳酸含量使用高效液相色谱仪（Agilent 1260，美国）测定；乙酸、丙酸和丁酸含量使用气相色谱仪（Agilent 7890A，美国）测定［10］；NH3-N 测定方法参照T/CAAA 003-2018 中的苯酚−次氯酸钠比色法测定［11］。

其余青贮饲料四分法取150 g，65 ℃烘干48 h，测定干物质含量（dry matter，DM）；干样用于粗蛋白（crude pro⁃tein，CP）、可溶性碳水化合物（water soluble carbohydrates，WSC）、中性洗涤纤维（neutral detergent fiber，NDF）和酸性洗涤纤维（acid detergent fiber，ADF）含量的测定，各指标 3 次重复。CP 含量采用凯氏定氮法测定［12］，NDF 和ADF 含量采用范氏法测定［12］，WSC 含量采用蒽酮比色法测定［13］。根据 NDF 和 ADF 含量计算相对饲料价值（rel⁃ative feed value，RFV）［14］。

1.4 青贮饲料发酵品质的评分

参照日本草地畜产协会制定的青贮饲料发酵品质V-score 评分标准［15］，根据NH3-N/TN、AA、PA 及BA 含量计算V-score 评分，满分为100 分，得分越高，发酵品质越好。

1.5 青贮饲料有氧稳定性分析

采用天贺MDL-1048A 高精度温度记录仪说（上海）进行采集开包后青贮料暴露在空气中的实时温度，每隔30 min 记录一次温度［16］。每个处理3 次重复，有氧暴露7 d 终止试验。

1.6 统计分析

采用Excel 2007 和DPS 7.05 软件进行数据处理以及双因素方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 菌酸添加剂及尿素添加量对紫花苜蓿混合青贮营养品质和发酵品质的影响

双因素方差分析结果表明（表2），菌酸添加剂种类对紫花苜蓿混合青贮pH 值和NH3-N/TN 均有显著影响（P＜0.05），对AA 含量有极显著影响（P＜0.01），对其他指标无显著性影响（P＞0.05）；尿素添加量对紫花苜蓿混合青贮DM 含量有显著影响（P＜0.05），对AA 含量和NH3-N/TN 有极显著影响（P＜0.01），对其他指标无显著性影响（P＞0.05）；菌酸添加剂和尿素添加量的交互作用对紫花苜蓿混合青贮AA 含量有显著影响（P＜0.05），对 CP、NDF、ADF、RFV、pH 值、PA、BA 含量均有极显著影响（P＜0.01）；对其他指标均无显著影响（P＞0.05）。

2.2 菌酸添加剂对紫花苜蓿混合青贮发酵品质和营养品质的影响

菌酸添加剂多重比较表明（表 3），LA 组的 pH 值为 4.44，显著低于 AS 组（4.75）（P＜0.05）；LA 组的 AA、PA、BA 含量和 NH3-N/TN 显著低于 AS 组（P＜0.05）；LA 组的 LA 含量比 AS 组高，但不存在显著差异（P＞0.05）。LA 组的 CP、RFV 指标显著优于 AS 组（P＜0.05）；LA 组的 NDF、ADF、WSC 含量显著低于 AS 组（P＜0.05）；LA 组的干物质含量高于AS 组，但无显著差异（P＞0.05）。综合来看，乳酸菌处理组的青贮效果好于有机酸盐处理组。

2.3 尿素添加量对紫花苜蓿混合青贮发酵品质和营养品质的影响

尿素添加量多重比较表明（表4），U1组的pH 值最低（4.38），显著低于其他处理组（P＜0.05），U3组的pH 值最高；各处理组的LA 含量不存在显著性差异（P＞0.05），但随着尿素添加量的增加，LA 含量有减少的趋势；U3组的AA、PA 和 BA 含量和 NH3-N/TN 显著高于其他 3 组（P＜0.05）；NH3-N/TN 随尿素添加量的增加而显著升高。U1组的 DM 含量显著高于其他组（P＜0.05）；U0组的 CP 含量显著低于 U1、U2和 U3组（P＜0.05），其中 U2组的 CP含量最高，为 17.52%；U1、U2和 U3组的 NDF 和 ADF 含量显著低于 U0组（P＜0.05），其中 U1组最低，分别为37.40% 和 21.10%；U1、U2和 U3组的 RFV 显著高于 U0组（P＜0.05），其中 U1组的 RFV 最高，为 180.56。综合来看，U1和U2组的青贮效果优于U3和U0组。

表2 添加剂种类和尿素添加量对紫花苜蓿混合青贮的影响Table 2 Effects of additive types and different urea addition on alfalfa mixed silage

表3 菌酸添加剂对紫花苜蓿混合青贮营养品质和发酵品质的影响Table 3 Effects of different additives on fermentation quality and nutrient quality of the alfalfa mixed silage

2.4 尿素添加量对菌酸添加剂组紫花苜蓿混合青贮料pH 值、干物质和氨态氮/总氮的影响

分别对菌酸添加剂和不同尿素添加量混合青贮的pH、DM 和NH3-N/TN 进行单因素方差分析（表5），结果发现：乳酸菌作为添加剂时，U1组的干物质含量为41.77%，显著高于其他3 组（P＜0.05），pH 值为4.27，显著低于其他3 组（P＜0.05），其中U3组的pH 值最高。有机酸盐作为添加剂时，U1组的干物质含量为40.77%，显著高于U2和 U3组（P＜0.05），U1组的 pH 值为 4.48，显著低于 U2、U3和 U0组（P＜0.05）。菌酸添加剂的氨态氮/总氮值均随尿素添加量的增加而显著上升（P＜0.05）。

表4 不同尿素添加量对紫花苜蓿混合青贮发酵品质和营养品质的影响Table 4 Effects of different urea dosage on fermentation quality and nutrient quality of the alfalfa mixed silage

表5 尿素对不同添加剂组紫花苜蓿混合青贮pH、干物质和氨态氮/总氮的影响Table 5 Effects of additives and urea on fermentation quality of the alfalfa mixed silage

2.5 尿素添加量对菌酸添加剂组紫花苜蓿混合青贮料有机酸含量的影响

乳酸菌作为添加剂时，各尿素添加组的LA、AA 和PA 含量不存在显著差异（P＞0.05），仅U3组检测出BA；V-score 值随尿素添加量的增加呈下降趋势，其中U3组最低，为69.29，其他各组均高于90.00。有机酸盐作为添加剂时，各处理组的 LA 含量无显著差异（P＞0.05）；U3组的 AA、PA 和 BA 含量显著高于其他 3 组（P＜0.05）；U3组的V-score 值在同组中为最低，其他组评分均在87.67 分以上，属于青贮发酵品质良好（表6）。

2.6 尿素添加量对菌酸添加剂组紫花苜蓿混合青贮料营养品质的影响

乳酸菌作为添加剂时，各尿素添加组的WSC 含量无显著差异（P＞0.05）；CP 含量随尿素添加量的增加呈显著上升（P＜0.05）；U0组的ADF 显著高于其他组（P＜0.05），其中U3组的ADF 最低（18.91%）；同时U0组的NDF含量最高（39.41%），显著高于 U1和 U3组（P＜0.05），其中 U2组的 NDF 最低（35.94%）；各组的 RFV 均高于 U0组，U1和U3组的RFV 显著高于U0组（P＜0.05）。有机酸盐作为添加剂时，各试验组的CP 含量显著高于U0组（P＜0.05），其中 U2组的 CP 含量最高（17.79%），显著高于其他组（P＜0.05）；U1和U2组的 ADF 和 NDF 的含量显著低于U3和 U0组（P＜0.05），U1和 U2组的 RFV 显著优于 U3和 U0组（P＜0.05）（表 7）。

表6 添加剂和尿素对紫花苜蓿混合青贮有机酸的影响Table 6 Effects of additives and urea on organic acid of the alfalfa mixed silage

表7 添加剂和尿素对紫花苜蓿混合青贮营养品质的影响Table 7 Effects of additives and urea on nutritional quality of the alfalfa mixed silage

2.7 添加剂和尿素对紫花苜蓿混合青贮料有氧稳定性的影响

各处理组在有氧暴露7 d 的过程中，温度均没有超过室温2 ℃以上，无霉变发生，可见各处理组的有氧稳定性较好。

2.8 混合青贮效果的秩和比排序

对8 个酸菌+尿素添加量处理组合进行秩和比排序，以pH 为低优指标，乳酸含量、粗蛋白含量、RFV 和V-score 值为高优指标，计算秩和比RSR 值，RSR 值越高表示青贮效果越好，以RSR 值进行排序。结果表明，乳酸菌处理组的青贮效果普遍好于有机酸盐处理组，其中LAU1和LAU2处理组的青贮效果最好，其次是LAU3处理组，LAU1和LAU2处理组的效果相似，ASU3处理组的青贮效果最差（表8）。

表8 混合青贮各项指标值及其RSR 排序Table 8 The index values of mixed silage and RSR sequence

3 讨论

3.1 乳酸菌或有机酸盐与尿素复配对混合青贮发酵品质的影响

pH 值、有机酸含量和氨态氮/总氮值是衡量青贮饲料发酵品质的重要指标。品质优良的苜蓿青贮饲料pH≤4.4，NH3-N/TN＜10%［17］。本试验中乳酸菌各处理组的pH 值均低于有机酸盐处理组，这可能是由于紫花苜蓿表面乳酸菌数量有限，添加外源乳酸菌能迅速帮助乳酸菌建立菌群优势，利用青贮中的底物产生有机酸，降低青贮的pH 值；而有机酸盐中主要成分是丙酸，丙酸能在青贮前期快速的降低青贮pH 值，但也会影响乳酸菌的繁殖，使青贮后期pH 值下降速度减慢；张增欣等［18］在多花黑麦草（Lolium multiflorum）青贮中添加丙酸，亦发现添加丙酸会在发酵初期抑制乳酸菌的增殖，降低了乳酸含量和青贮后期pH 值。

本研究中随尿素添加量增加，紫花苜蓿混合青贮的pH 值和NH3-N/TN 值均显著上升，这与荣辉等［19］在象草（Pennisetum purpureum）青贮中的研究结果相似；覃方锉等［20］也发现，燕麦（Avena sativa）捆裹青贮中添加0.4%的尿素较未添加对照组的NH3-N 显著增加。常规青贮中的NH3-N 主要是来源于青贮初期牧草蛋白酶分解蛋白质产生的氨和胺，这也是青贮原料蛋白质损失的主要原因［21］。但添加尿素后，尿素释放的NH4+可增加 NH3-N 和TN 含量，并升高pH 值。因此，青贮中尿素添加量不可过高，否则尿素中NH4+的碱性作用对乳酸菌的抑制会影响青贮正常发酵。

乳酸和挥发性有机酸的产生与发酵过程中同型乳酸菌、异型乳酸菌以及其他产酸微生物组成以及发酵底物、发酵环境密切相关［22］。琚泽亮等［23］发现，燕麦和箭筈豌豆（Vicia sativa）混播捆裹青贮40 d 时，添加0.4%尿素处理的乳酸和丙酸含量显著低于未添加对照组，乙酸含量显著升高。随着青贮时间的延长，乳酸含量显著增多，乙酸含量逐渐增多，而丙酸在青贮80 d 后检测不到。Yunus 等［24］在象草（Pennisetum purpureum）青贮时添加糖蜜同时添加尿素较仅添加尿素的处理组的乳酸含量显著增加，而乙酸含量显著降低，但丁酸含量均较低，差异不大。Dos Santos 等［25］研究在高粱（Sorghum bicolor）青贮时分别加入 0.5%、1.0%、2.0% 和 4.0%DM 的尿素，青贮饲料的乳酸含量变化不大，且没有规律性；尿素添加量≤1.0%DM 含量时，乙酸含量随着尿素添加量增加而显著增加，但尿素添加量为2.0%DM 和4.0%DM 时，乙酸含量与1.0%DM 尿素添加处理组相差不大；添加尿素处理组的丁酸含量相差不大，但比未添加的对照组高。本研究中乳酸菌作为添加剂时，不同尿素添加量各组间乳酸、乙酸和丙酸含量均无显著性差异，而添加有机酸盐时，U3组的乳酸含量低于U1、U2和U0组，而U3组的乙酸和丙酸含量显著高于U1、U2和U0组。可见，尿素与乳酸菌、有机酸或糖蜜等添加剂进行复配使用时，对青贮发酵品质的影响不尽相同，需对青贮发酵过程中微生物构成、乳酸菌类型以及发酵底物等进行深入研究才可明确尿素在青贮发酵过程中的作用机理。

3.2 乳酸菌或有机酸盐与尿素复配对混合青贮营养品质的影响

CP 含量是评价青贮饲料营养品质最重要的指标之一。添加尿素可以增加青贮饲料中CP 含量，这在很多研究中得到证实［5，9，25］。Dos Santos 等［25］在高粱青贮中添加尿素发现，青贮饲料的 CP 含量随尿素添加呈线性极显著增加（P＜0.01）。本研究中乳酸菌添加组CP 含量随着尿素添加量的增加显著升高，但有机酸添加组的CP 含量在尿素添加量为 0、1.5、3.0 g·kg−1FW 时，随着尿素添加量显著增加，但当尿素添加量为 4.5 g·kg−1FW（ASU3）时，CP 含量显著低于ASU2处理组，但显著高于ASU1和U0处理组，这可能是因为青贮过程中过量尿素会使青贮发酵环境pH 上升，使喜中性偏碱性环境（pH 7.0～7.4）的梭菌（Clostridiumspp.）滋生，而梭菌可降解青贮饲料中有机氮化物，产生氨态氮、丁酸和胺等腐败物质，使得青贮饲料CP 含量低于其他处理组。本研究中ASU3处理组的氨态氮和丁酸含量高于其他处理组，也间接说明有机酸盐与过量尿素添加可能会促进梭菌滋生。

高粱青贮中添加尿素会使青贮饲料的NDF 含量与尿素添加量呈线性负相关（P＜0.05），尿素添加量为1.0%DM、2.0%DM 和4.0%DM 时，ADF 含量较未添加对照低［25］。本研究中乳酸菌组添加尿素的青贮料中NDF、ADF 含量均低于未添加处理组，这可能是因为尿素水解后产生的OH−作用于细胞壁，破坏木质素分子间的键，同时NH4+的亲水性促进了细胞壁的膨胀，导致青贮饲料中非结构性碳水化合物成分含量下降，导致NDF含量和ADF 含量下降；有机酸组添加尿素的青贮料中NDF 含量均低于未添加对照组，U3处理组的ADF 高于U0处理组，但没有显著性差异，U1和U2处理组的ADF 显著低于U0组。可见，尿素在青贮过程中并不能像氨化反应一样，完全发挥氨解反应，这可能与青贮的酸性环境与尿素的有限用量有关。

4 结论

乳酸菌添加剂处理组的紫花苜蓿混合青贮饲料的pH、氨态氮/总氮和营养品质均显著优于有机酸盐处理组（P＜0.05）；紫花苜蓿混合青贮中氨态氮/总氮值含量随尿素添加量增加呈上升趋势；添加乳酸菌的同时添加1.5或3.0 g·kg−1FW 的尿素，紫花苜蓿、稻秸和麦麸混合青贮效果最佳。