水杨酸对葡萄果实酚类物质积累的影响

卫 颖，杨 波，李 敏，梁长梅，张鹏飞，温鹏飞，牛铁泉

（1.山西农业大学园艺学院，山西太谷030801；2.山西农业大学信息科学与工程学院，山西太谷030801）

葡萄（Vitis viniferaL.）中含有丰富的糖、有机酸、及各种氨基酸等营养物质，而酚类物质作为一种功能性物质在葡萄的生长发育过程中发挥着重要作用[1]。前人证实，葡萄果实中存在多种酚类物质（如黄酮醇、黄酮[2]、酚酸和黄烷-3- 醇[3]以及白藜芦醇[4]等）与其采后运输、储存、保鲜、抗病性等密切相关[1]。黄烷-3- 醇是葡萄中重要的多酚类物质之一[5-6]，广泛存在干果实、果皮及种子中。葡萄果实中常见的黄烷-3- 醇单体有儿茶素（Catechin，C）、表儿茶素（Epicatechin，EC）、表棓儿茶素（Epigallocatechin，EGC）和表儿茶素没食子酸酯（Epicatechin gallate）[7]。由于黄烷-3- 醇具有较强抗氧化性能[8]，在抗菌、抗病、抗癌、降血压、防止心脏病变[9]等方面具有重要作用。

水杨酸（Salicylic acid，SA）是一种重要的植物激素[10]，也是一种调节植物生长、发育和应激反应的次生代谢产物[11]，能诱导防御化合物的生物合成，如多酚或抗病相关蛋白[12]。已有大量研究表明，SA可以提高植物的抗盐性[13]、抗寒性以及抗热性[14]等，且诱导效果因SA 的浓度、逆境类型及植物种类而异。KUMARI 等[15]研究发现，荔枝果实经SA 和壳聚糖的联合处理后，减轻了荔枝果皮褐变，提高了抗氧化性和花青素含量。姚军[16]等研究发现，采后哈密瓜喷施不同浓度SA，能抑制果实的腐烂，增强苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）和过氧化物酶（POD）活性。代红军等[17]研究发现，不同浓度的SA 处理赤霞珠果实，均可提高果皮中总类黄酮和白藜芦醇含量。龚良建等[18]证实了SA 能有效防止红地球葡萄细胞膜的过氧化反应，增强保护性酶的相关活性，从而提高葡萄抗寒性。但遗憾的是，目前有关SA 在植物的抗逆性方面研究较多，但对果实中多酚类物质积累的影响，特别是对黄烷-3- 醇的积累报道较少。

本研究采用常规生理生化方法和HPLC 方法，测定喷施外源SA 后极早蜜葡萄成熟果实中多酚类物质含量，特别是黄烷-3- 醇，探究外源SA 对葡萄多酚类物质以及黄烷-3- 醇积累的影响，为后续研究SA 对黄烷-3- 醇的调控机理提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料及试剂

供试材料为极早蜜葡萄（Vitis viniferaL.cv.Jizaomi）。水杨酸购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 试验地概况

试验材料定植于山西农业大学园艺站葡萄大棚，篱架，株行距1.0 m×2.5 m，肥水条件一般，正常管理。该园地处晋中盆地，东经112°55′，北纬37°42′，年平均气温10.3 ℃，年平均降雨量458 mm。

1.3 试验设计

共设4 个SA 处理，分别于幼果期（6 月17 日）、转色期（7 月23 日）、成熟期（9 月14 日）喷施100 mg/L SA 或蒸馏水，具体如表1 所示。于成熟期喷前0 h、喷后3、6、12、24 h 进行采样，采集果穗后去除畸形果、腐烂果，置于冰盒中带回实验室，经液氮速冻后-50 ℃保存备用。每个处理设置3 次重复。

表1 SA 喷施处理

1.4 测定项目及方法

1.4.1 多酚类物质含量测定 总酚、总类黄酮含量参照邢延富[19]的方法测定；总黄烷醇含量参照WATERHOUSE 等[20]的方法测定；总黄烷-3- 醇含量参照杨丽等[8]方法测定，稍作修改。

1.4.2 黄烷-3- 醇单体含量测定 参照温鹏飞[7]的方法，稍作修改。准确称取0.5 g 液氮研磨的葡萄果实去籽，加入3 mL 70%甲醇，摇匀后避光超声提取20 min，12 000 r/min 4 ℃离心10 min，取上清液经0.45 μm 有机滤膜过滤后进样分析。色谱条件：Themo Fisher Ultimate 3000 色谱仪，Syncronis C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，280 μm），Dionex Ultimate 300 DiodeArrayDetector 检测器，检测波长为280 nm，柱温为30 ℃，进样量为20 μL。流动相A 为甲醇，流动相B 为1.3%冰乙酸，流速1.0 mL/min。洗脱程序：0～5 min，A 相为0～20%；5～10 min，A 相为20%～25%；10～25 min，A 相为25%～30%；25～30 min，A相为30%～20%；30～35 min，A 相为20%～0。4 种黄烷-3- 醇单体的分离色谱如图1 所示。

1.5 数据分析

利用Excel 2019 进行数据统计分析并绘图，利用SAS 8.0 软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 水杨酸对极早蜜葡萄果实总酚含量的影响

从图2 可以看出，在葡萄果实发育不同时期喷施SA，对成熟期葡萄果实总酚积累的影响不同。处理1 和处理3 的总酚含量在3 h 时达到最高，此时处理1 显著高于处理2，处理3 极显著高于处理2。而处理2 在12、24 h时总酚含量较高但低于对照，且在12 h 极显著高于其他处理，在24 h时处理2与对照、其他处理无显著性差异。

2.2 水杨酸对极早蜜葡萄果实总类黄酮含量的影响

不同水杨酸处理对极早蜜葡萄果实总类黄酮积累的影响如图3 所示。处理3 的总类黄酮含量在0 h 时出现最高值，且显著高于处理1；在3 h 时极显著高于处理1 和处理2，但低于对照。除3 h 之外的其他时间，处理2 的总类黄酮含量均高于对照和其他处理，且在12 h 差异达到显著水平，在24 h时极显著高于处理1 和处理3。因此，在葡萄果实发育不同时期喷施不同次数的SA，对成熟期葡萄果实的总类黄酮积累的影响不同。

2.3 水杨酸对极早蜜葡萄果实总黄烷醇含量的影响

不同水杨酸处理对极早蜜葡萄果实总黄烷醇积累的影响如图4 所示。处理3 在6 h 时总黄烷醇含量出现最高值，且极显著高于处理1。处理2 在24 h之内的总黄烷醇含量基本保持不变，且在6 h时极显著高于处理1，在12、24 h时均极显著高于其他处理。而处理1 在3 h 时总黄烷醇含量达到最高且显著高于对照。在0 h 时3 个处理的总黄烷醇含量均显著高于对照。因此，在葡萄果实发育不同时期喷施不同次数的SA，对成熟期葡萄果实总黄烷醇积累的作用不同。

2.4 水杨酸对极早蜜葡萄果实总黄烷-3-醇含量的影响

从图5 可以看出，在葡萄果实发育不同时期喷施SA，对成熟期葡萄果实的总黄烷-3- 醇积累作用有所不同。处理3 的总黄烷-3- 醇含量在6 h 时出现最高值且显著高于处理1，在3 h 时极显著高于处理2 和对照。而处理2 的总黄烷-3- 醇含量在24 h时出现最高值且极显著高于处理3，在12 h时极显著高于对照和其他处理。处理1 在3 h 时总黄烷-3- 醇含量极显著高于对照和其他处理。在0 h 时3 个处理的总黄烷-3- 醇含量均显著高于对照。

2.5 水杨酸对极早蜜葡萄果实儿茶素含量的影响

从图6 可以看出，不同水杨酸处理对极早蜜成熟葡萄果实儿茶素积累的影响有所不同。在0 h 时处理2 和处理3 的儿茶素含量显著高于对照和处理1。而处理3 在3 h 时儿茶素含量出现最高值，均高于对照和其他处理且差异不显著。处理2 在6 h时儿茶素含量均显著高于对照和处理3。3 个处理在12、24 h时的儿茶素含量均低于对照。

2.6 水杨酸对极早蜜葡萄果实表儿茶素含量的影响

由图7 可以看出，在葡萄果实发育不同时期喷施SA，对成熟期葡萄果实的表儿茶素积累作用有所不同。在0 h 时处理2 和处理3 的表儿茶素含量显著高于对照和处理1。处理3 在3 h 时表儿茶素含量出现最高值，且极显著高于对照和其他处理。而处理1 的表儿茶素含量在12 h 时出现最高值且显著高于处理3，在6 h 时显著高于其他处理。

2.7 水杨酸对极早蜜葡萄果实表棓儿茶素含量的影响

不同水杨酸处理对极早蜜葡萄果实表棓儿茶素积累的影响如图8 所示。处理3 的表棓儿茶素含量在3 h 时出现最高值且极显著高于对照，在0 h时显著高于处理1 和对照。而处理2 在24 h之内表棓儿茶素含量基本保持不变，在12、24 h时表棓儿茶素含量均极显著高于对照和其他处理。除12 h以外的其余时间，处理1 的表棓儿茶素含量要高于对照但低于处理2 或处理3。因而，在葡萄果实发育不同时期喷施不同次数的SA，对成熟期葡萄果实表棓儿茶素积累的作用不同。

2.8 水杨酸对极早蜜葡萄果实表儿茶素没食子酸酯含量的影响

由图9 可以看出，在葡萄果实发育不同时期喷施SA，对成熟期葡萄果实的表儿茶素没食子酸酯积累作用有所不同。在0 h 时3 个处理的表儿茶素没食子酸酯含量均显著高于对照。处理3 在6 h 时表儿茶素没食子酸酯含量要显著高于处理1 和对照，而在3 h 时差异不显著。而处理2 的表儿茶素没食子酸酯含量在24 h时出现最高值且极显著高于其他处理，在6 h 时显著高于处理1 和对照，在12 h 时差异不显著。

3 结论与讨论

本试验发现，极早蜜葡萄果实发育时期喷施不同次数的100 mg/L SA，在24 h内对成熟期果实的酚类物质积累会有不同程度的影响。喷施SA 后某个时间的成熟果实中总酚、总类黄酮、总黄烷醇、总黄烷-3- 醇含量高于对照，说明SA 可以促进葡萄多酚类物质积累，这与前人结果[17，21]一致。不同的是，3 个处理之间比较发现，幼果期、转色期和成熟期3 次喷施SA 后，其成熟果实在0～6 h 酚类物质的积累有明显提高；而幼果期、转色期2 次喷施SA后，在6～24 h 葡萄成熟果实酚类物质的积累作用较为明显；幼果期喷施SA 对酚类物质积累的影响不明显。

葡萄果实中黄烷-3- 醇类物质的积累主要是在葡萄进入转色期前，尤其是在葡萄果实发育的早期阶段，而后伴随着葡萄果实的成熟，其呈现下降趋势[22-23]。本试验在葡萄成熟期果实中检测到了儿茶素、表儿茶素、表棓儿茶素、表儿茶素没食子酸酯4 种黄烷-3- 醇单体，这4 种单体在成熟期葡萄中含量较少，这与前人研究结果一致，其中表棓儿茶素、表儿茶素没食子酸酯含量较高，儿茶素、表儿茶素含量较少。

牛艳丽[24]研究发现，叶面喷施SA 不会改变葡萄果实黄烷醇类多酚的积累规律，但可不同程度诱导黄烷醇类多酚的积累，其结果与本试验相符。对于儿茶素、表儿茶素、表棓儿茶素而言，幼果期、转色期和成熟期3 次喷施SA 后3 h 的含量最高；而幼果期、转色期2 次喷施SA 后24 h 的表儿茶没食子酸酯含量最高。其含量升高的原因可能是SA 激活了葡萄酚类物质相关代谢酶活性，从而提高了葡萄中儿茶素、表棓儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯含量。前人已经证实，花青素还原酶（Anthocyanidin reductase，ANR）和无色花青素还原酶（Leucoanthocyanidin reductase，LAR）参与黄烷-3-醇的合成，LAR 催化无色花青素转化为儿茶素，而ANR 催化花青素合成表儿茶素[25]。因此，SA 可能是通过激活ANR、LAR 酶活性，从而提高了葡萄中黄烷-3- 醇含量[26]。

从整体上看，与对照相比，喷施水杨酸后24 h内成熟果实的酚类物质含量无明显提高。其结果可能因为受到葡萄品种、SA 浓度、果实取样部位等的影响。目前，前人在酿酒葡萄品种如赤霞珠、梅鹿辄、蛇龙珠上的研究较多，而对鲜食葡萄品种的研究较少。前人研究发现，SA 对赤霞珠、梅鹿辄、蛇龙珠果实的酚类物质积累的最佳质量浓度分别是100、50、100 mg/L[27-28]。赵旗峰等[29]研究发现，不同品种、不同营养系间葡萄果实的多酚类物质含量存在显著差异。由此表明，SA 对酚类物质的积累会受到葡萄品种的影响。而葡萄果实取样部位的不同，也会导致SA 对酚类物质的影响不同。例如，蛇龙珠葡萄的果皮、果籽中白藜芦醇含量分别以50、25 mg/L SA 处理的效果最好[30]，且果皮和果籽中酚类物质含量要远高于果肉。不同浓度的SA 对酚类物质的影响也不同，其中，赤霞珠果皮的总类黄酮含量以50 mg/LSA 处理效果最好，白藜芦醇含量以25 mg/L SA 处理效果最好[17]。另外，酚类物质也会因SA 处理时期的不同而产生影响。目前，大多数报道均是在果实采前、采后施用SA[31]，而在果实生长期进行处理的报道较少。因而，本试验在极早蜜葡萄的生长发育时期喷施100 mg/L SA，具有一定的研究意义。