吲哚胺2，3-双加氧酶在哮喘小鼠肺组织的表达及与γ干扰素的关系

许春娜，李晓，汤昱，张磊，王秀芳

支气管哮喘(简称哮喘)是一种慢性的气道炎症性疾病，具有异质性的特点。对国内外儿童群体研究中发现，哮喘患病率是逐年增高的，这将给患儿家庭及社会带来沉重的负担[1]，吲哚胺2，3双加氧酶(indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO)在人和动物的组织中低水平表达，为色氨酸代谢的限速酶。色氨酸在参与变态反应性疾病发生过程中起关键作用[2]，是免疫耐受机制的重要参与者，IDO作为色氨酸的限速酶，其表达水平有重要意义[3]。γ干扰素(interferon-γ，IFN-γ)具有免疫调节、抗病毒等多种活性，其是由分泌蛋白质组成[4]。通过调控嗜酸性粒细胞、肥大细胞等细胞活性参与呼吸道病情进展过程[5]。Ünüvar等[6]在对过敏性疾病的研究中证实，IDO随着IFN-γ的刺激而增加。故本文检测小鼠肺组织中IDO、IFN-γ的水平，阐述其在哮喘小鼠体内的表达及相关关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择6周龄SPF级雌性BALB/c小鼠21只，体质量18～23 g，由河南省实验动物中心提供，生产许可证号SCXK(豫)2010-0002。

1.2 试剂 尘螨提取物(丹麦ALK公司)，Anti-Indoleamine 2，3-dioxygenase antibodyab(ABCAM公司)，eECL Western Blot Kit试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)，ELISA试剂盒(上海森雄科技有限公司)。

1.3 小鼠哮喘模型的建立及实验分组 按随机数字表法将21只小鼠分为对照组、干预组、哮喘组3组，每组7只。哮喘组及干预组小鼠致敏：将含2 000 U/mL的尘螨提取液100 μL(每毫升尘螨提取液中氢氧化铝含2%)第1天皮下注射，第3、5、7天腹腔注射，将含4 000 U/mL的尘螨提取液50 μL于第9、11、13天腹腔注射；对照组小鼠以相同方法、相同剂量生理盐水替代致敏。哮喘组小鼠激发：先用0.3%戊巴比妥0.3 mL以腹腔注射的方法麻醉小鼠后以含4 000 U/mL尘螨提取液50 μL/次于第15、16、17天滴鼻激发小鼠，每日1次。干预组小鼠激发：用布地奈德混悬液2 mL雾化吸入30 min后进行滴鼻，余同哮喘组；对照组小鼠激发：用相同剂量的生理盐水滴鼻。

1.4 小鼠支气管肺泡灌洗术及处理肺标本 将小鼠于末次激发24 h后进行麻醉，取左肺，置于-80 ℃冰箱保存，行右支气管插管后灌洗，重复灌洗3次，最后可回抽出1.0～1.5 mL的生理盐水，回收率>80%，转移至EP管中，离心10 min，取上清液用于细胞因子检测，细胞沉淀重悬后计算细胞总数，取右肺组织，石蜡包埋切片，分别行HE染色及免疫组织化学染色。显微镜下看同级支气管周围炎性细胞及支气管壁的改变；在高倍镜(×40)下查看及测定阳性细胞蛋白表达，结果以其单位面积累积光密度值表示。

1.5 ELISA法测IFN-γ水平 将血清及支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)上清液从-20 ℃冰箱取出，打开IFN-γ ELISA试剂盒，严格按照说明书操作。

1.6 Western blot法测IDO蛋白表达 取1 g左肺组织提取蛋白，研磨处理1～2 min后编号，孵育30 min并进行离心，收集上清液，置于-20 ℃冰箱保存。用考马斯亮蓝G-250和牛血清白蛋白定量，分装，置于-20 ℃冰箱备用，配制15%的聚丙烯酸胺凝胶，将溶液注入玻璃板夹层中聚合30 min，100 ℃水浴5 min、离心，加点样孔和蛋白Marker后进行电泳。考马斯亮蓝G-250、丽春红染色液进行染色，脱色至蛋白条带清晰，将胶浸入转膜缓冲液中转膜，完成后加脱脂奶粉封闭，置摇床上摇动2 h，然后稀释的一抗中4 ℃过夜，弃含一抗的封闭液，进行二抗的孵育后曝光显影。

2 结果

2.1 肺组织病理学 哮喘组：可见以嗜酸性粒细胞、淋巴细胞为主的大量炎细胞浸润，小鼠气道壁厚度增加，气道内有上皮细胞脱落及杯状细胞化生，并有胶原纤维增生。干预组与哮喘组小鼠比较程度较轻。而对照组小鼠则可见散在的炎细胞、气道壁厚度正常，杯状细胞无化生表现。见图1。哮喘组小鼠气道壁厚度高于干预组及对照组，干预组高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

图1 3组小鼠肺组织病理变化(苏木精-伊红染色，×40)

表1 3组小鼠气道壁厚度

2.2 3组小鼠BALF细胞计数及分类比较 见表2。哮喘组BALF中细胞总数及分类高于干预组及对照组，干预组高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 3组小鼠BALF中细胞计数及分类比较

2.3 3组小鼠IDO蛋白表达量比较 免疫组织化学染色结果显示阳性细胞区为褐色，主要分布在气管壁、小血管壁周围，见图2。测定阳性区积分光密度值表示IDO蛋白表达量，哮喘组表达量低于干预组及对照组，干预组表达量低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

图2 3组小鼠肺组织IDO阳性细胞染色结果(免疫组织化学染色，×40)

表3 3组小鼠IDO蛋白表达量

2.4 3组小鼠血清及BALF液中IFN-γ水平比较 见表4。哮喘组血清及BALF液中IFN-γ水平低于干预组和对照组，干预组低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表4 3组小鼠血清中及BALF中IFN-γ水平比较

2.5 小鼠肺组织中IDO蛋白表达结果 见图3。哮喘组IDO灰度值低于干预组及对照组，干预组低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

图3 各组小鼠肺组织中IDO的蛋白表达量

表5 3组小鼠肺组织中IDO灰度值

2.6 相关性分析 IFN-γ水平在血清中与BALF中呈正相关(r=0.981，P<0.01)；肺组织内IDO蛋白的表达与IFN-γ水平在血清中及BALF中均呈正相关(r=0.956，0.963，P<0.01)，见图4。

图4 IDO表达与IFN-γ水平的相关性分析

3 讨论

研究发现在气道重构过程中发挥重要作用的有嗜酸粒细胞、淋巴细胞和中性粒细胞等及其分泌的细胞因子[7]。文中以尘螨提取液致敏小鼠的方法建立支气管哮喘模型，肺组织显微镜下可见哮喘组以嗜酸性粒细胞、淋巴细胞为主的大量炎细胞浸润，BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞数、淋巴细胞数高于其他两组。

IFN-γ影响非IgE介导的气道炎症基因[8]，其水平变化与支气管哮喘发生和发展存在相关性[9]。本实验同时检测小鼠血清及BALF中IFN-γ的水平，利用两组数据进行比较以便更好的反应数据的真实性。IDO作为限速酶在体内催化色氨酸分解代谢[10]，参与诱导机体的免疫耐受途径。在动物实验研究中观察到哮喘小鼠IDO在蛋白质和mRNA水平上都有明显的低表达[11]。在临床研究中观察到健康儿童的IDO水平高于哮喘患儿，哮喘患儿诱导痰和外周血中IDO表达明显降低，提示IDO活性可抑制气道过敏反应，在过敏性哮喘的致病机制中具有保护作用[12-13]。

IFN-γ是干扰素家族成员，而研究发现其是诱导IDO表达的最强刺激因子之一[14]。涂媛媛等[15]加入不同浓度的IFN-γ在早孕绒毛和蜕膜组织中研究发现，IFN-γ通过调节IDO的表达可使实验对象母胎耐受，IFN-γ的浓度与IDO的表达呈正相关，IFN-γ上调IDO的表达，从而保护胎儿免受母体的排斥。Oh等[16]在实验中发现IFN-γ以激活信号转导和转录激活因子1来增加IDO的表达。Zhang等[17]研究中显示IFN-γ能显著激活角质形成细胞的IDO表达。多位学者的研究均说明IFN-γ的水平与IDO表达有关，故在本实验中检测小鼠体内IDO与IFN-γ的水平来阐述两者的关系，结果显示两者在小鼠体内是呈正相关，与上述研究中的结果是一致的。另有研究发现抑制IFN-γ受体并消除IFN-γ的作用，会抑制IFN-γ诱导IDO1的表达[18]。利用IFN-γ治疗后，间充质干细胞中IDO的表达增加，在丝素蛋白纳米纤维板上生长的间充质干细胞在IFN-γ处理后显示IDO表达增强[19]。本研究中结果与上述观点也一致。且最新研究发现一氧化氮敏感性效应机制是IFN-γ诱导IDO表达的机制之一[20-21]。

有研究者把免疫刺激序列寡脱氧核苷酸注射哮喘小鼠体内，发现Th2细胞反应明显减轻，证实是通过增强树突状细胞表达IDO的结果[22]。在本文中运用Western blot法及免疫组织化学法检测小鼠体内IDO的表达，实验数据均表明IDO在哮喘组是低表达，当IDO表达减少时使免疫耐受功能减弱或缺如，易于支气管哮喘的形成或使其加重。