紫杉醇对FLT3-ITD突变阳性急性髓系白血病细胞株MOLM-13增殖与凋亡的影响*

粟燕云，吴梅青，刘振芳，周宝文，白子文，庞如利，赵卫华

（广西医科大学第一附属医院血液内科，南宁 530021）

急性髓系白血病(acute myelocytic leukemia,AML)是一类起源于造血干细胞的血液系统恶性肿瘤，具有高度异质性[1]。FLT3-ITD突变阳性AML患者的发生率高达30%[2]，且预后差，复发率高[3]。以FLT3为靶点的小分子抑制剂虽可达到完全缓解，但是FLT3 二次突变引发的获得性耐药易导致复发。因此，有必要为FLT3-ITD 突变阳性的AML 患者探寻更为经济有效的药物。紫杉醇是一种具有独特抗癌特性的化疗药物，可通过不同途径诱导多种白血病细胞凋亡，被认为是目前最有效的天然抗癌药物之一[4]。但紫杉醇对FLT3-ITD 突变阳性AML 细胞株MOLM-13 是否具有抑制作用目前尚不清楚。因此，本研究旨在探讨紫杉醇对FLT3-ITD突变阳性AML细胞株MOLM-13增殖与凋亡的影响，并初步探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、药物及主要试剂 AML细胞株MOLM-13 购自南京科佰生物科技有限公司。紫杉醇购自上海源叶生物科技有限公司。CCK8试剂盒购自日本同仁公司；凋亡检测试剂盒购自美国BD公司；逆转录、RT-PCR试剂盒均购自大连Takara公司。引物由生工合成。抗AKT 抗体（4691）、抗磷酸化（p-）AKT抗体（4060）均购自CST 公司。

1.2 细胞培养 MOLM-13 细胞株生长于含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 mg/mL链霉素的RPMI-1640完全培养基中，置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，每隔2 d 更换一次培养基。取生长状态良好、处于对数生长期的细胞进行实验。

1.3 CCK-8 法检测细胞活性 实验设对照组（0 nmol/L紫杉醇）和不同浓度（2 nmol/L、4 nmol/L、6 nmol/L、8 nmol/L、10 nmol/L）紫杉醇组，每组设3个复孔。取对数生长期的细胞，将细胞以2×105个/mL 密度接种至96 孔板中，每孔100 μL，培养24 h、48 h、72 h后加入10 μL的CCK-8溶液，孵育1～4 h，酶标仪测定各孔450 nm处的吸光度(OD)值，取平均值，按以下公式计算细胞抑制率：抑制率=［（阴性对照孔OD 值－实验孔OD 值）/（阴性对照孔OD 值－空白孔OD 值）］×100%。实验重复3 次，用Graphpad prism 8软件计算IC50。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡 实验设对照组（0 nmol/L紫杉醇）和不同浓度（2 nmol/L、4 nmol/L、8 nmol/L）紫杉醇组，干预48 h后，收集细胞，预冷的PBS 洗涤细胞，用1×Binding Buffer 重悬细胞，混匀后，取200 μL细胞悬液加到流式管中，加入5 μL Annexin V，室温下避光孵育15 min；加入5 μL PI 以及300 μL 1×Binding Buffer，混匀，5 min内上机检测。

1.5 实时荧光定量PCR（qPCR）法检测FLT3、PI3K、AKT、mTOR 基因表达 实验设对照组（0 nmol/L 紫杉醇）和10 nmol/L、20 nmol/L 紫杉醇组，干预48 h 后，采用Trizol 法提取各组细胞的总RNA，逆转录为cDNA后进行PCR扩增。PCR反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火、延伸30 s，共40个循环。以GAPDH为内参基因，采用2－ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。引物序列如下：GAPDH 上游：5’-CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3’，下游：5’-TAAAAAGCAGCCCTGGTGAC-3’ʹ；FLT3 上游：5’-GCAATCATAAGCACCAGCCAGGAG-3’，下游：5’-TTCTGCGAGCACTTGAGGTTTCC-3’；PI3K 上游：5’-CTTTGCGACAAGACTGCCGAGAG-3’，下游：5’-CGCCTGAAGCTGAGCAACATCC-3’；AKT 上游：5’-ATGGAGTATGCCAACGGGGG-3’，下游：5’-TGTCGCGGTATACCACGTCC-3’；mTOR上游：5’-CTTGCTGAACTGGAGGCTGATGG-3’，下游：5’-CCGTTTTCTTATGGGCTGGCTCTC-3’。

1.6 Western blotting 法检测AKT 和p-AKT 蛋白表达 实验分组同“1.5”，处理48 h后，收集细胞，预冷PBS 洗涤细胞2 次，加入适量蛋白裂解液提取总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度，加入适量蛋白上样缓冲液并进行蛋白变性；采用SDS-PAGE分离蛋白，转移至PVDF 膜，5%封闭液封闭1 h；加入相应一抗GAPDH（1∶10 000）、AKT（1∶1 000）、p-AKT（1∶1 000），4 ℃冰箱孵育过夜；加入二抗（1∶2 000）室温下孵育1 h；ECL 显影曝光。以GAPDH 为内参，采用Image J 软件分析蛋白条带灰度值。以目的蛋白条带灰度值与内参GAPDH蛋白条带灰度值的比值为目的蛋白表达量。

1.7 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 紫杉醇对MOLM-13细胞增殖的影响 随着药物浓度的增加以及作用时间的延长，紫杉醇对细胞的增殖抑制作用在一定范围内逐渐增强，见图1。作用24 h、48 h、72 h 的IC50分别为14.19 nmol/L、4.73 nmol/L、3.39 nmol/L。

图1 不同浓度紫杉醇作用不同时间对MOLM-13细胞增殖的影响

2.2 紫杉醇对MOLM-13细胞凋亡的影响 不同浓度紫杉醇（2 nmol/L、4 nmol/L、8 nmol/L）分别作用于MOLM-13 细胞48 h，其凋亡率分别为（24.63±1.02）%、（32.73±0.55）%、（63.2±0.87）%，其中浓度为4 nmol/L、8 nmol/L 的紫杉醇组凋亡率，与对照组（0 nmol/L 紫杉醇）相比，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见图2。

2.3 紫杉醇对MOLM-13 细胞FLT3、PI3K/AKT/mTOR 通路相关基因和蛋白表达的影响 10 nmol/L、20 nmol/L 紫杉醇分别作用于MOLM-13 细胞48 h，结果显示：紫杉醇组FLT3、PI3K、AKT、mTOR mRNA相对表达量及p-AKT、AKT蛋白表达量显著降低，与对照组（0 nmol/L紫杉醇）相比，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图3。

图2 不同浓度紫杉醇作用48 h对MOLM-13细胞凋亡的影响

图3 紫杉醇对MOLM-13细胞FLT3、PI3K/AKT/mTOR通路相关基因和蛋白表达的影响

3 讨论

近年来，对于AML 的治疗有所进展，但是FLT3-ITD 突变阳性AML 患者的复发率仍较高，生存期短[5]。而针对FLT3 的小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)的单药治疗临床效应小，可能是剂量毒性限制了其对FLT3 的抑制作用[6]。此外，大多数FLT3-ITD 突变阳性的AML 患者会很快复发[7-8]，小部分患者则由于FLT3继发性TKD突变而发生获得性耐药[9]，故FLT3抑制剂难以满足临床需求,有必要为FLT3-ITD突变阳性的AML患者探寻更为经济有效的药物。

紫杉醇是一种有效的抗癌药物，主要通过促进微管聚合，稳定微管结构，妨碍纺锤体形成，抑制细胞有丝分裂，将细胞阻滞在G2/M 期而发挥其抗癌作用，被广泛应用于多种恶性肿瘤的治疗，包括白血病[10]。近年来研究表明，除了上述抗癌机制，紫杉醇还可通过不同的途径诱导细胞凋亡，例如，通过激活JNK 信号通路，提高caspase-3、caspase-9 的活性进而促进白血病细胞株K562、U937 细胞凋亡[11-12]。本研究首次发现紫杉醇对FLT3-ITD突变阳性的AML 细胞株MOLM-13 也具有一定的增殖抑制作用，且呈典型的浓度、时间依赖性，作用24 h、48 h、72 h 的IC50分别为14.41 nmol/L、5.65 nmol/L、3.92 nmol/L。此外，紫杉醇还能诱导MOLM-13 细胞发生凋亡，作用48 h的凋亡率高达（63.2±0.87）%，明显高于对照组（P＜0.01）。上述实验结果提示紫杉醇对MOLM-13细胞株具有一定的抑制作用。

突变基因FLT3-ITD所编码的FLT3受体能够在非配体依赖性的情况下持续性自动磷酸化，异常激活下游多种与细胞的生存、增殖、凋亡等生物学特性相关的信号通路，如PI3K/AKT、MAPK、STAT5等，从而诱导细胞增殖，抑制细胞凋亡[13-15]。因此FLT3是一个较好的治疗靶点。本研究发现，紫杉醇不仅能在一定程度上抑制FLT3基因的表达，还能下调PI3K/AKT/mTOR 信号通路相关基因PI3K、AKT、mTOR 及AKT、p-AKT 蛋白的表达。其中，AKT 激酶是PI3K 最重要的底物，活化的AKT 既能够使促凋亡蛋白Bad和caspase-9发生磷酸化失活，亦可磷酸化激活IκB激酶(IKK)，间接活化转录因子NF-κB，然后启动一系列抗凋亡基因的表达,发挥其抗凋亡作用[16]。因此，笔者推测，紫杉醇对MOLM-13细胞的抑制作用可能与其下调FLT3基因的表达和抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的活性有关。但是，紫杉醇具体是否是通过抑制FLT3基因的表达进而抑制其下游PI3K/AKT/mTOR信号通路的活性尚需要进一步的研究。值得一提的是，以往的研究表明，约有50%～70%的AML 患者存在PI3K/AKT/mTOR信号通路的持续性异常激活[17]，并且与FLT3抑制剂索拉非尼耐药密切相关，而抑制该通路的活性能够诱导耐药细胞凋亡并抑制其克隆形成[18]。因此，结合上述研究结果，本组进一步猜测将低剂量紫杉醇与索拉非尼联合作用于MOLM-13细胞可能具有更好的抑制作用。

综上，紫杉醇对FLT3-ITD 突变阳性的AML 细胞株MOLM-13具有明显的增殖抑制及诱导凋亡作用，其机制可能与下调FLT3 基因的表达，抑制PI3K/AKT/mTOR 信号通路的活性有关，本研究为将紫杉醇用于AML 患者的治疗提供一定的理论依据和实验基础。