星状神经节阻滞对无血预充体外循环大鼠认知功能的影响*

龚飘飘，蔡 亮，张炳东

（广西医科大学第一附属医院，南宁 530021）

体外循环（cardiopulmonary bypass，CPB）是将患者体内的血液引流到体外，经过膜式氧合器进行气体交换，再通过泵的作用泵入体内，使机体的氧合和血供维持相对的状态，作为一种有效的持续支持血流动力学的工具和替代心肺循环的技术，在临床上各个领域的应用已引起广泛重视[1]。目前在动物CPB实验中，绝大多数的CPB预充液还是采用了体外全血，本实验通过无血预充进行CPB来模拟临床，可以有效减少临床用血。而术后认知功能障碍（postoperative cognitive dysfunction，POCD）是CPB术后一种常见的并发症，严重影响患者术后的生活质量。星状神经节阻滞（stellate ganglion block，SGB）是通过局麻药的扩散和浸润作用，引起由星状神经节支配区域的交感神经受到抑制，SGB已用于各种疼痛治疗、创伤后应激障碍、失血性休克导致功能障碍等[2-4]。无血预充下CPB 已成为目前动物研究的主要模型，POCD作为主要的并发症，其发生率居高不下，降低POCD 发生率仍是急需解决的问题之一。因此，本实验将SGB用于无血预充的CPB中，探讨SGB在无血预充时对CPB术后POCD发生率的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 30 只健康SD 成年雄性大鼠，由广西医科大学实验动物中心提供（许可证编号：SCXK 桂2014-0002），体重400～450 g。将大鼠随机分为3 组：假手术组（S 组）、CPB 组（C 组）和SGB+CPB 组（SC 组），每组10 只。S 组大鼠只进行动静脉置管，C组大鼠建立CPB模型转流2 h，SC组大鼠建立SGB后立即行CPB模型转流2 h。

1.2 CPB 模型建立 腹腔注射1%戊巴比妥钠50 mg/kg 将大鼠麻醉后仰卧固定于手术台上，行气管插管，连接HX-300S 动物呼吸机（成都泰盟软件有限公司），控制潮气量为8 mL/kg，呼吸频率为60次/min，维持呼气末二氧化碳4.66～5.99 kPa 的机械通气。CPB 采用右侧颈外静脉—右侧股动脉。右侧颈外静脉用22G静脉穿刺针置管引流，右侧股动脉用24G静脉穿刺针进行灌注，尾动脉穿刺术监测动脉血压和血气分析。静脉给予400 IU/kg的肝素钠，激活全血凝固时间（activated clotting time，ACT）≥480 s 后进行CPB 转流[5]。CPB 的预冲液为6 mL 羟乙基淀粉、4 mL乳酸林格氏液、0.5 mL 5%NaHCO、0.5 mL 呋塞米和1 mL 20%甘露醇。整个体外预充管道通过Stockert Ⅲ双头滚压泵（德国Stockert 公司）和小动物膜肺（东莞科威医疗器械有限公司），CPB转流2 h后用1∶1的鱼精蛋白拮抗肝素。

1.3 SGB 大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠30 mg/kg，在仰卧位的状态下行SGB。在大鼠左侧胸锁关节外侧0.3 cm 处注射0.1 mL 1%利多卡因进行局麻，用1 mL注射器垂直进针穿刺，针尖斜面朝上，朝向足端约0.3 cm 时注射0.25%罗哌卡因0.5 mL+1%利多卡因0.5 mL。SGB 成功的标志为出现明显Horner 综合征，表现为大鼠左侧眼窝内陷、瞳孔缩小、眼睑下垂和眼裂变小。SGB成功后进行CPB模型建立。

1.4 血液生化指标检测 分别于实验开始前（T0）和实验开始后1 h（T1）、2 h（T2）、6 h（T3）、24 h（T4）、72 h（T5）、第7 天（T6）抽取大鼠尾动脉血0.4 mL，用i-STAT1 血气分析仪（美国Medtroniz 公司）测量酸碱（pH）值、钠离子（Na+）、钾离子（K+）、游离钙离子（iCa2+）、血红蛋白（Hb）和血糖（Glu）浓度。

1.5 血浆白介素-2（IL-2）含量检测 将大鼠麻醉后，在右颈内静脉处取血0.8 mL，置于抗凝管中，4 ℃下1 000 r/min 离心10 min，收集上清液，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测T0～T6 时间点各组大鼠血浆中IL-2 的含量。试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，检测过程严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.6 苏木精－伊红（HE）染色检测 将各组大鼠麻醉后断颈取脑，用组织固定液固定24 h 后修块，阶梯式脱水，石蜡包埋，冠状位切片，厚约5 μm。HE依次染色，脱水封片，光学显微镜观察大鼠海马的组织结构。

1.7 尼氏染色检测 将各组大鼠脑组织的石蜡切片脱蜡后用甲苯胺蓝染色，冰醋酸分化，脱水透明封片，显微镜观察海马神经元形态学特征。

1.8 术后认知功能检测 将T4～T6 时间段的各组大鼠放入水迷宫中进行测试。测试开始前让大鼠在水中自由游泳2 min，找到水中平台，若大鼠未及时找到平台，则引导大鼠找到平台[6]。正式测试时间为90 s，大鼠随机从4个象限进入水池，找到平台后休息2 min，再进入下一个象限测试，记录大鼠的运动轨迹、各象限的穿越次数和潜伏期时间。

1.9 统计学方法 所有数据均采用SPSS 23.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同时间段各组大鼠血液生化指标比较 与S组相比，C组和SC组在T2～T3时间段的pH值、Na+、K+的浓度和Glu 浓度明显升高，iCa2+浓度明显下降。在T2 时间段，三组间比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；在T3 时间段，与S 组比较，C 组的pH 值、Na+、K+、Glu 的浓度升高且iCa2+的浓度降低（P＜0.05），SC 组的Na+浓度升高且iCa2+浓度降低（P＜0.05），与C组相比，SC组的pH值、Na+、K+、Glu浓度降低且iCa2+的浓度升高（P＜0.05），见表1。

2.2 不同时间段各组大鼠Hb含量比较 C组和SC组在T2～T5 时间段的Hb 的含量低于S 组，且在T2时间段最低（均P＜0.05）。在T2～T4 时间段，C 组Hb 含量低于SC 组，且均低于S 组（P＜0.05）；在T5时间段，C 组和SC 组Hb 含量低于S 组（P＜0.05），见表2。

表1 不同时间段各组大鼠血液生化指标比较

表1 不同时间段各组大鼠血液生化指标比较

与S组比较，*P＜0.05；与C组比较，#P＜0.05。

表2 不同时间段各组大鼠Hb含量比较g/dL，

表2 不同时间段各组大鼠Hb含量比较g/dL，

与S组比较，*P＜0.05；与C组比较，#P＜0.05。

2.3 不同时间段各组大鼠血浆IL-2浓度比较C 组和SC 组的IL-2 浓度在T2～T4 时间段高于S 组（均P＜0.05），且在T2 时间段最高。在T2～T4时间段C组IL-2浓度高于SC组，且均高于S组（P＜0.05），见图1。

图1 不同时间段各组大鼠血浆IL-2浓度

2.4 大鼠海马组织病理学改变 HE染色观察，S组DG 区的大鼠海马细胞排列紧密而整齐；而C 组大鼠海马组织受损严重，细胞排列紊乱疏松、神经元弥漫性空泡变性、大量小胶质细胞浸润、核固缩明显；SC 组的病理学改变较C 组明显缓解，细胞排列较为规则，小胶质细胞、核固缩细胞和神经元空泡变性的数量也明显减少，见图2。

2.5 大鼠海马神经元形态学改变 尼氏染色观察，S 组的大鼠海马CA3 区神经元排列紧密且层次清晰、结构完整且神经元中尼氏小体含量丰富；而C组神经元带不完整、神经元缺失严重，且尼氏小体解体明显；SC 组神经元受损情况较C 组明显好转，神经元排列相对规整，神经元缺失数量减少，且尼氏小体含量相对丰富，见图3。

2.6 不同时间段各组大鼠水迷宫运动数据 在T4～T6时间段，C组比SC组大鼠在空间探索中象限穿越次数增加，逃避潜伏期时间延长，且两组数值明显高于S组（均P＜0.05），见图4。

图2 大鼠大脑组织切片HE染色（×200）

图3 大脑海马组织切片尼氏染色（×400）

图4 不同时间段各组大鼠象限穿越次数和潜伏期

3 讨论

Na+和K+是维持细胞膜稳定的重要因素,血液中Na+和K+的浓度直接到影响机体内环境的稳定。有研究表明Na+-K+-ATP 酶，钙活化性K+通道活性增加，可以有效维持血管内皮平滑肌的舒张[7-8]。细胞内Ca2+信号驱动内皮集落形成细胞增殖、迁移、归巢和新血管形成，可以有效维持突触的结构稳态和神经传递[9-10]。本研究结果显示，SC 组中Na+、K+、Glu浓度和Hb含量低于C组，高于S组；SC组中iCa2+高于C 组，低于S 组（P＜0.05）。因此，SGB 可有效减少无血预充CPB造成高钾、高钠、高糖、低钙导致的不良反应，有效阻滞痛觉神经的传导和血管的运动，缓解肌肉紧张；中枢作用可通过下丘脑的调节维持机体正常的免疫功能、内分泌功能和植物神经功能，维护机体内环境的稳定，加快机体修复[11-13]。

IL-2 作为有效的抗炎因子，主要来源于CD 辅助T 细胞下，从而持续低水平状态。在无血预充的CPB 中，可能反复激活了Prdm1 编码的转录因子B淋巴细胞激活，诱导成熟蛋白1 抑制IL-2 的大量产生[14]。本研究结果显示，SC 组IL-2 浓度高于S 组，低于C组（P＜0.05），反映C组炎症因子的浓度高于SC组，高于C组，说明SGB可以通过激活部分免疫细胞，如T 细胞受体、自然杀伤细胞，自然杀伤T 细胞，树突状细胞和肥大细胞大量分泌IL-2，使体内IL-2的浓度迅速增加，从而抑制炎症因子的产生[15]。

在CPB中，无论是缺血还是炎症均会引起细胞水肿进而导致脑水肿，最先体现于星形胶质细胞，表现为空泡样变性。在CPB 中会增加反应性的星形胶质细胞反应性的星形胶质细胞中的血管内皮生长因子，从而会破坏血脑屏障，并加速星形胶质细胞肿胀，而无血预充下的CPB 会使其进一步加剧，加重脑水肿[16]。小胶质细胞可诱导或调节细胞反应，也是产生炎症的关键介质，过度激活引起神经元损伤，其活化程度与脑组织的损伤程度密切有关[17]。尼氏小体一般分布于神经元的树突和胞质内，作为神经细胞特有的结构，会随神经元的损伤而减少或溶解[18]。本研究结果显示，SC组细胞的排列、神经元空泡样变性以及小胶质细胞的活化数量明显少于C 组，且尼氏小体含量明显多于C 组。说明SGB可以改善CPB导致的大脑水肿，减少神经炎症，缓解缺血缺氧的情况。

有研究表明，Morris 水迷宫广泛用于空间记忆和学习，可作为术后认知功能的检测实验，但运动功能缺陷不能作为水迷宫认知功能测定的混淆因素[6]。本研究结果显示，C组平均潜伏期长于SC组，象限穿越次数多于SC组（P＜0.05），边缘活动增多，中央活动减少，说明大鼠的空间记忆能力下降。表明SGB可以减少CPB引起的POCD。

研究显示，在无血预充的情况下进行CPB容易加重机体内环境紊乱，导致组织、器官缺血缺氧坏死，如外周末梢功能循环障碍、认知功能障碍、延长术后恢复时间甚至实验动物死亡[19-21]。然而因血源紧张、用血困难，在无血预充下进行CPB 是不可避免的临床问题。而SGB 可以有效减少无血预充下进行CPB带来的不良反应，从而对大鼠产生保护作用，减少POCD的发生率。

综上所述，SGB可以在一定程度上稳定大鼠在无血预充条件下进行CPB时机体的内环境，调控血浆中IL-2的表达，减轻大脑的组织细胞水肿和神经炎症反应，改善大脑缺血缺氧的状况，从而减少大鼠POCD的发生。