咖啡因对UV诱导的HaCaT细胞氧化损伤的保护作用及机制

干春霞，胡财江，王立甜，高梓琪，李 今， 徐 晶，王宣军,3，盛 军，徐欢欢,3*

(1.云南农业大学普洱茶学教育部重点实验室，云南 昆明 650201；2.云南农业大学食品科学技术学院，云南 昆明 650201；3.云南农业大学理学院，云南 昆明 650201；4.云南生物资源保护与利用国家重点实验室，云南 昆明 650201)

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器设备

人永生化表皮角质细胞(HaCaT)购于中国科学院昆明细胞库；高糖培养基DMEM/HIGH GLUCOSE(Thermo)；FBS(Foetal Bovine Serum，胎牛血清)购于Biological Industries公司；胰蛋白酶—EDTA消化液(T1300)、青链霉素混合液(P1400)、高效RIPA裂解液(R0010)购于北京Solarbio Life Science公司。

咖啡因(Caffeine)、二甲基亚砜、组织固定液、结晶紫购于美国Sigma公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0010)购于Beyotime生物技术公司；MMP9抗体(ab76003)、Acetyl-p53抗体(ab109396)购于Abcam公司；p-p38一抗(4511)、p-ERK一抗(4370)、p-JNK一抗(9255)、SIRT3一抗(5490)购于Cell Signaling Technology(CST)公司；二抗Anti-mouse IgG、Anti-rabbit IgG购于R&D Systems公司；细胞质活性氧荧光染料CM-H2DCFDA(C6827)、特异性线粒体超氧化物荧光染料MitoSOX Red(M36008)购于Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 仪器与设备

细胞培养箱(BINDER)；移液器(Thermo)；倒置荧光显微镜(Leica)；Automated cell counter(C10281，Invitrogen)；酶标仪(Thermo)；低速离心机(中佳 SC-3616)。

1.3 方法

1.3.1 氧化损伤细胞模型建立 复苏人永生化表皮角质细胞(HaCaT)，在含有10 %胎牛血清的高糖细胞培养基中培养，置于含5 % CO2、37 ℃的培养箱中，连续传代2次使得细胞生长活力一致且细胞状态稳定。经过前期预实验，使用功率为20 W的UVB紫外照射灯管对贴壁50 %左右的HaCaT细胞进行照射，构建UV诱导的HaCaT细胞氧化损伤模型，辐射剂量为0.53 J·cm-2。实验设4组处理：处理1(咖啡因0 μg·mL-1、无UV照射)、处理2(咖啡因0 μg·mL-1、UV照射)、处理3(咖啡因50 μg·mL-1、UV照射)和处理4(咖啡因100 μg·mL-1、UV照射)。

1.3.2 结晶紫染色实验 以建立的HaCaT细胞氧化损伤模型为基础，通过结晶紫染色实验检测咖啡因对于细胞生长的影响。各组细胞以80万每皿的细胞密度接种至60 mm培养皿中过夜，待细胞贴壁牢固且细胞密度为50 %左右时对各组细胞进行咖啡因预处理1 h，然后进行UV照射。24 h后缓慢吸除培养基，用PBS清洗2～3次，使用4 %多聚甲醛固定20 min，固定结束后用UP水清洗1次，使用0.1 %结晶紫染液染色10 min，用UP水小心清洗3次后拍照记录。

1.3.3 细胞内活性氧含量测定 将各组细胞以10万每孔的密度接种至已经放入细胞爬片的12孔板，待细胞贴壁牢固且细胞密度为50 %左右时对各组细胞进行咖啡因预处理及UV照射，24 h后去除培养基，用PBS清洗2次，加入含有5 μmol/L荧光染料的无酚红培养基1 mL，于37 ℃细胞培养箱孵育15 min。取出细胞爬片贴在载玻片上，荧光显微镜下观察各组细胞的荧光强度并拍照记录[25]。使用Image J软件分析各组荧光强度的相对量。

1.3.4 线粒体内活性氧含量测定 与细胞内活性氧含量检测方式一致，各组细胞分别经过诱导处理24 h后，加入含有5 μmol/L荧光染料的无酚红培养基1 mL，于37 ℃细胞培养箱孵育15 min。取出细胞爬片并贴在载玻片上，在荧光显微镜下观察各组细胞的荧光强度并拍照记录[25]。使用Image J软件分析各组荧光强度的相对量。

1.3.5 蛋白免疫印迹 以建立的HaCaT细胞氧化损伤模型为基础，通过蛋白质免疫印迹探究咖啡因对UV诱导的HaCaT细胞氧化损伤的保护作用机制。各组HaCaT细胞经过诱导处理24 h后，消化、离心，收集细胞。用RIPA蛋白高效裂解液提取各组细胞中的总蛋白，用BCA蛋白定量法测得各组细胞总蛋白浓度。每组上样20 μg总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，2 h后转PVDF膜，用5 %的脱脂奶粉封闭1 h后与p-p38、p-ERK、p-JNK、MMP9、SIRT3、Acetyl-p53及β-tubulin一抗孵育，4 ℃过夜。一抗回收后用TBST洗涤3次，室温与兔抗或鼠抗IgG二抗孵育1 h。孵育结束后TSBT洗涤3次，利用ECL化学发光法显影检测。使用AlphaView软件分析各目的蛋白的相对表达量。

1.3.6 数据处理 所有数据以均值±标准误差(X ± SEM)表示，两组间差异采用t检验。*表示与处理1相比，差异显著(P<0.05)；**表示与处理1相比，差异极显著(P<0.01)；***表示与处理1相比，差异高度显著(P<0.001)；#表示与处理2相比，差异显著(P<0.05)；##表示与处理2相比，差异极显著(P<0.01)；###表示与处理2相比，差异高度显著(P<0.001)。图像采用 GraphPad Prism5.0软件处理。

2 结果与分析

2.1 咖啡因对UV照射后HaCaT细胞存活率的影响

与处理1相比，处理2的HaCaT细胞经过紫外线照射后，细胞存活率显著降低(图1)，说明造模成功；与处理2相比，处理3和处理4的细胞存活率显著增加，并且呈现浓度依赖趋势。由结晶紫染色结果可看出，咖啡因能增加UV照射后HaCaT细胞存活率。

2.2 咖啡因对UV照射后HaCaT细胞内活性氧积累的影响

为明确咖啡因对UV诱导HaCaT细胞损伤的保护作用，采用CM-H2DCFDA荧光染料对细胞内活性氧含量进行检测。荧光染色结果显示，咖啡因能显著减少UV照射引起的HaCaT细胞内的活性氧累积(图2)。与处理1相比，处理2细胞经紫外线照射后，细胞内活性氧含量显著增加(P<0.001)；与处理2相比，处理3细胞内的活性氧的含量显著降低(P<0.05)，处理4细胞内的活性氧的含量极显著降低(P<0.01)，表明咖啡因减少了UV照射引起的细胞内活性氧的积累。

2.3 咖啡因对UV照射后HaCaT细胞线粒体内活性氧积累的影响

细胞内活性氧增加的同时也伴随着线粒体内活性氧的增加。为研究UV照射对HaCaT细胞线粒体的损伤和咖啡因的保护作用，采用MitoSOX Red荧光染色检测线粒体内活性氧的含量。图3显示，与处理1相比，处理2 HaCaT细胞线粒体内活性氧含量显著增加(P<0.01)；而与处理2相比，处理3线粒体内活性氧含量有下降趋势，处理4线粒体内活性氧含量极显著降低(P<0.01)。表明咖啡因处理具有减少UV诱导的HaCaT细胞线粒体内活性氧积累的作用。

2.4 咖啡因对UV照射后HaCaT细胞内SIRT3/MAPKs通路的影响

为明确咖啡因对UV诱导的HaCaT细胞氧化损伤的保护机制，采用Western blot评价了咖啡因对UV诱导的HaCaT细胞氧化应激重要信号通路的影响。结果如图4所示，咖啡因能够显著降低UV照射引起的MAPKs的磷酸化水平升高，同时显著上调SIRT3的蛋白表达水平。与处理1相比，处理2的HaCaT细胞经过紫外线照射后，p-p38、p-ERK、p-JNK的磷酸化水平均有极显著或高度显著升高(P<0.01或P<0.001)；而与处理2相比，处理3和处理4的细胞内p-p38、p-JNK、p-ERK蛋白表达显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01)。

MMP9是降解细胞外基质成分如弹性纤维等的重要蛋白酶。与处理1相比，处理2 HaCaT细胞内MMP9蛋白的表达水平极显著增加(P<0.01)；而与处理2相比，处理3和处理4的细胞内MMP9蛋白显著下降(P<0.05)。

SIRT3是线粒体抗氧化相关信号通路的重要调节蛋白。实验显示，与处理1相比，处理2 HaCaT细胞内SIRT3蛋白表达极显著降低(P<0.01)，Acetyl-p53蛋白高度显著增加(P<0.001)。与处理2相比，处理3和处理4的细胞内SIRT3蛋白表达极显著增加(P<0.01)；与处理2相比，Acetyl-p53蛋白表达水平处理3显著降低(P<0.05)、处理4高度显著降低(P<0.001)。据此表明，咖啡因可通过影响SIRT3/MAPKs信号通路，对UV诱导的HaCaT细胞氧化损伤起保护作用。

3 讨 论

长期过量的日光照射是引起多种皮肤疾病的基本原因，也是诱发多种恶性或良性肿瘤的重要因素之一。研究表明日光中UVB引起的表皮细胞损伤与氧化应激有关，当细胞处于氧化应激状态时会引起HaCaT细胞内ROS的产生和积累，导致皮肤外观损伤甚至皮肤病[26]。过多的ROS是导致氧化损伤的主要原因，它可以直接或间接作用于细胞内的大分子或细胞器致使细胞损伤[27-28]。

通过UV照射HaCaT细胞建立氧化应激模型。结晶紫染色实验结果表明，UV照射能降低HaCaT细胞的存活率。在UV照射前1 h对HaCaT细胞进行预处理，考察不同浓度的咖啡因对UV诱导的HaCaT细胞氧化损伤的保护作用。结果表明，咖啡因能增加UV照射后HaCaT细胞的存活率。

正常生理情况下，活性氧的含量与机体抗氧化能力处于平衡，但在UV刺激状态下，HaCaT细胞内氧化还原稳态被打破，细胞质和线粒体内活性氧含量增加，引起氧化损伤。通过实验显示，咖啡因可降低HaCaT细胞内和线粒体中活性氧的积累，显现咖啡因可在通过减少细胞内ROS的积累、缓解氧化应激增强细胞的存活率起到对UV诱导的HaCaT细胞氧化损伤的保护作用，这对咖啡因在皮肤抗氧化产品中的应用提供了理论依据。

活性氧在细胞内信号传导过程中具有重要作用，正常状态下活性氧可以促进细胞增殖更新，而氧化应激状态下，过多的活性氧使胞内许多大分子物质发生过氧化，激活下游信号通路造成细胞损伤[29-31]。已有研究表明，咖啡因能够通过调节SIRT3/MAPK信号通路，缓解APPH诱导的氧化损伤[15]。为了探究咖啡因对UV诱导的氧化损伤的作用机制，通过蛋白质免疫印迹检测了MAPKs通路中p-p38、p-JNK以及p-ERK的磷酸化水平。实验结果表明，紫外线照射后，处理2的HaCaT细胞内MAPKs(p-p38、p-JNK和p-ERK)的磷酸化水平升高；使用不同浓度的咖啡因对细胞进行处理后，p-p38、p-JNK和p-ERK蛋白表达降低，说明咖啡因对UV诱导的HaCaT氧化损伤的保护作用是通过降低MAPKs的磷酸化完成的。同时，UV照射会引起HaCaT细胞线粒体内SIRT3蛋白的表达降低，Acetyl-p53蛋白增加；处理3和处理4的细胞内SIRT3蛋白表达高于处理1，Acetyl-p53蛋白表达水平则降低。此外，与处理2相比，处理3和处理4的HaCaT细胞中，MMP9的蛋白表达水平降低。这些结果表明，咖啡因可以影响氧化应激过程中SIRT3/MAPKs信号转导通路，进而对UV照射的HaCaT细胞产生保护作用。

4 结 论

咖啡因可以保护UV诱导的HaCaT细胞，减少其氧化损伤，这是通过调节SIRT3/MAPKs/ROS途径完成的。该研究结果为含咖啡因的植物资源的综合开发利用提供了实验依据，也为咖啡因通过抗氧化机制来缓解UV诱导的损伤奠定了理论基础。