黄连根腐病土赤壳属病原真菌的鉴定

伍晓丽,陈大霞,刘 飞,王 钰,李隆云*

(1.重庆市中药研究院种植研究所，重庆 400065；2.中国中医科学院中药资源中心重庆分中心，重庆 400065；3.重庆市中药研究院大健康中心，重庆 400065)

【研究意义】黄连是我国传统的名贵中药材，为毛茛科植物黄连(CoptischinensisFranch．)、 三角 叶 黄 连(CoptisdeltoideaC.Y.Cheng et Hsiao)或云连(Coptisteetawal1．)的干燥根茎。以上3种分别习称味连、雅连、云连，是我国内销和出口的大宗药用植物。其中，味连品质好，产量最高；黄连性寒，味苦，具有泻火解毒、清热燥湿的功效，使用十分广泛。据不完全统计，13部宋代以前著作的3.2万多个古方剂中，含有黄连的方剂有1760种，占5 %左右[1]。重庆市石柱县是味连主产区，也是全国闻名的“黄连之乡”，黄连产量约占全国总产量的60 %左右。石柱黄连于2006年获得了“国家地理标志”产品称号，目前石柱黄连的种植面积达3333 hm2[2]。黄连根腐病近年来在多个产地发生，造成减产3～4万元/667m2，严重挫伤连农种植积极性，影响了该产业的发展。本项目组前期研究发现，根腐病是多种真菌复合侵染所导致的病害，目前已鉴定出少部分镰刀菌属的病原真菌，但还有一些病原真菌的分类地位尚不明确，开展这些病原菌的鉴定工作，对防治该病具有重要意义。【前人研究进展】黄连根腐病的相关研究报道很少，宋旭红等通过Illumina高通量测度比较根腐病黄连根际土壤、健康黄连根际和未种植黄连的土壤的微生物群落，发现二者微生物群落有显著不同：镰刀菌属的相对丰度，根腐病黄连根际土壤显著高于健康黄连根际土；细菌种群丰富度，黄连病株根际土壤低于未种植黄连土壤和健康黄连根际土壤[3-4]。Luo X M等[5]发现，茄腐镰刀菌是黄连根腐病的病原真菌之一，本课题组通过病根组织分离内生真菌，所分离出的真菌进行离体回接和活体回接筛选出病原真菌，分子鉴定和形态鉴定结果表明，尖孢镰刀菌也是致病菌之一，它在黄连病根中分离频率较高，是镰刀菌属的优势菌，且致病力很强[6]。【本研究切入点】本课题组前期研究发现，根腐病病株根部土赤壳属真菌分离频率很高，且该属真菌可能含根腐病病原[7]，但目前尚无相关研究报道。而准确鉴定出所有的病原菌是防治的基础。【拟解决的关键问题】本研究采集石柱黄连根腐病植株根条，使用组织分离法进行可培养真菌分离后，通过离体根条回接和活体回接对其中的土赤壳属真菌进行致病性检测，对其ITS序列进行测序，测序结果与NCBI中的数据进行比对，分子鉴定结果结合形态鉴定，将病原菌鉴定到种，为黄连根腐病的防治奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料、试剂及仪器参照文献[7]。

1.2 试验方法

1.2.1 可培养内生真菌分离与纯化 分离培养方法参照文献[7]。培养4～8 d后，挑取组织周围长出的棕黄色、毡绒状、生长缓慢的菌丝[8]，转接PDA中纯化，直到获得纯菌落。

1.2.2 可培养真菌分子鉴定 分子鉴定步骤参照文献[7]。

1.2.3 离体回接 根据分子鉴定的结果，每一个菌种选择1个菌株做离体回接，回接方法见文献[6]。

1.2.4 活体回接 取离体回接发病严重的菌株做回接，回接方法及病情指数计算和病菌再分离见文献[6]。

1.2.5 菌株形态鉴定 用插片法对致病菌进行形态鉴定。

1.2.6 致病菌遗传变异分析 在研究过程中发现2株菌的菌落形态发生了变异，利用SeqMan软件对2个变异菌株和它们的原始菌株ITS序列进行了突变位点比对分析。

2 结果与分析

2.1 土赤壳属真菌分子鉴定结果

从黄连病根中共分离到土赤壳属真菌38株(表1)，Ilyonectriadestructans、Ilyonectrialiliigena、Ilyonectriasp.isolate Cg07是其中的优势菌。此外，5.6、B5在保存过程中菌株形态发生了明显变化，菌丝变得更短、稀疏，由棕黄色变成了米白色，变异后的菌株编号分别是5.6W、B5W。

2.2 离体回接发病情况

离体回接结果表明，除5.6和10.4外，其余菌均有强弱不等的致病性，B5、5.6和它们的变异株致病性不同。因此挑取除5.6和10.4外的8个菌株做活体回接试验，结果见图1和表2。

2.3 活体回接发病情况

活体回接的根均有不同程度的发病(表3、图2)，其中12.12病情指数最高，其次是12.4。B5和它的变异株致病性不同。发病的根部分或全部变黑腐烂。病情轻缓的植株叶片较正常，有新叶生长；病情严重的植株新芽极少或没有，大量叶片枯死。而活体回接发病的根进行再分离，仍然能分离到回接所用菌株。

2.4 致病菌形态鉴定

选取致病性最强的两株菌12.4和12.12进行形态观察。

12.4(图3)。菌落在PDA上生长慢，气生菌丝很短，呈毡绒状，幼嫩时白色，后变成棕黄色。菌落生长前期主要产生分生孢子，后期产生厚垣孢子。菌丝粗，直径2.7～5.4 μm，黄色，有明显的隔，节间向内缢缩，呈现腊肠状。厚垣孢子多，球形或椭球形，光滑，间生或顶生，单生、成串状或成簇生长，茶褐色，直径11.5～16.7 μm。分生孢子梗多为单生。产生大分生孢子和小分生孢子。小分生孢子0～1 隔，无色透明，大小5.2～13.0 μm×2.2～5.3 μm；大分生孢子圆柱状，稍弯，无色，1～3 隔，1 隔大孢子 19.7～35.4 μm×1.8～8.5 μm；2隔大孢子22.8～37.5 μm×4.2～7.5 μm；3隔大孢子38.1～43.4 μm×3.1～7.9 μm。分子鉴定结果表明该菌与I.destructansisolate 17eum01-01相似性99 %，而I.destructans是Cylindrocarpondestructans的有性型。参考龙月娟等的文献报道[9]，将该菌鉴定为I.destructans(C.destructans)。

表1 黄连病根中土赤壳属真菌的分子鉴定结果

表2 黄连根条离体回接结果

12.12(图4)。菌落形态类似12.4。菌落生长前期主要产生分生孢子，后期产生厚垣孢子。显微镜下，菌丝形状类似12.4，直径3.6～6.7 μm。厚垣孢子很多，光滑，球状或椭圆形，间生或顶生，单生或成串生长，浅褐色，直径11.2～15.3 μm。分生孢子梗单生或分枝。分生孢子长圆形，无色透明，直或微弯，大分生孢子36.5～44.8 μm×8.8～10.3 μm，1～3隔，小分生孢子12.1～26.8 μm×5.9～7.6 μm，0～1隔。分子鉴定结果表明该菌与I.liliigenastrain G2相似性99 %。参考Ana Cabral等的文献报道[10]，将该菌鉴定为I.liliigena。

2.5 突变菌株比对分析结果

菌株5.6和B5 ITS序列碱基的突变全部发生在该序列的两端，包括碱基的突变和缺失。突变的碱基数不等，5.6有21个，B5有10个。2个菌的ITS序列碱基易突变区域都集中在两端1～23个碱基以内(图5)。

表3 黄连根条活体回接结果

3 讨 论

本研究结果表明，土赤壳属的Ilyonectriadestructans和I.liliigena是导致黄连根腐病的致病菌，而已报道的黄连根腐病菌均属于镰刀菌属[5-6]。土赤壳属的真菌作为植物根腐病病原菌报道的不多[11-12]。I.destructans能引起虎舌红茎腐病[13]。I.liliigena导致百合根腐病，以其寄主王百合(Liliumregale)命名[10]。土赤壳属的上述2个菌虽然导致黄连根腐病，但从根条腐烂程度看，其对根条的侵染能力不如镰刀菌强[6]。这两株真菌在病根中分离频率比较高，也属于主要病原真菌。

不少土赤壳属菌株在PDA上培养过程中也会发生形态变异，由棕黄色变成米白色，菌丝变得更短。离体回接和活体回接的结果表明，其致病性也发生了变化。分子鉴定结果表明其ITS序列碱基也发生了突变。说明这类真菌变异性比较强。真菌在生长、培养过程中发生基因组的突变，导致其生理生化特征、毒性、致病性变化的现象比较常见。引起小麦赤霉病的禾谷镰刀菌(FusariumgraminearumSchw.)在PDA平板上可产生菌落角变，纯化的角变菌株较亲本菌落生长速度慢，分生孢子和子囊壳产生能力下降或丧失，对小麦寄主的致病力减弱[14]。蝉拟青霉[Paecilomycescicadae(Mique1) Samson]菌株在沙氏培养基上可产生孢子型和菌丝型两类不同的突变菌株，它们和原始菌株相比较，胞外多糖、蛋白酶、SOD等的含量以及对甘蓝蚜的致病性均有显著变化[15]。由此也推测，在大田里，这些土赤壳属真菌会不断发生基因变异，导致其生物学特性和致病性变化，因此生产上靠单一农药防控效果不好，需采用复配农药制剂，同时结合调整栽培措施、土壤治理等手段进行综合防治。

本研究虽然鉴定出了部分土赤壳属的病原真菌，但以下问题有待深入探讨：从分子鉴定结果看，本研究分离到的土赤壳菌有6种，活体回接结果表明，除了I.destructans和I.liliigena外，剩余的菌也有一定致病性，不排除它们在基因突变后，致病性增强的可能。因此，后期我们将对土赤壳属病原真菌基因突变前后的致病性、耐药性、生物学特性变化等问题开展深入研究。

4 结 论

采用分子鉴定和形态鉴定相结合的方法，对近年来流行的黄连根腐病病原菌进行鉴定，鉴定结果为Ilyonectriadestructans和I.liliigena，且这类土赤壳属真菌基因易发生突变。