云南省副猪嗜血杆菌分离鉴定及其16S rRNA生物信息学分析

赵 津，吴林蔚，李 珂，赵国洪，杨锁柱，王洪伟，韩建强*

(1.玉溪农业职业技术学院，云南 玉溪 653106；2.玉溪市疾病预防控制中心，云南 玉溪 653100；3.云南省畜牧兽医科学院，云南 昆明 650224)

【研究意义】副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis，HPS)引起猪的一种以急性败血症、多发性浆膜炎和关节炎为特征的疾病，主要感染断奶后和保育阶段的猪，常见于5～8周龄。在集约化猪场中，副猪嗜血杆菌病常在猪群遭受环境不良、转群、去势、免疫注射、饲养不当等因素影响，或者猪群感染繁殖与呼吸障碍综合征等免疫抑制性疾病时伺机暴发，造成严重的经济损失[1-3]。研究当地流行血清型和敏感药物可以指导疫苗和药物的选用。【前人研究进展】副猪嗜血杆菌对营养环境要求较高，除了需要胰蛋白大豆琼脂培养基外，还需要添加V因子或者NAD，以及胎牛血清。近年来，副猪嗜血杆菌病已成为危害世界各国养猪业的典型细菌性疾病，该病在中国各省已有报道，各地方分离株对药物敏感性和耐药性有一定差异[4-10]。Kielstein等[11]用传统的琼脂扩散血清学法将副猪嗜血杆菌分为15型，另外有20 %的临床分离株不能分型。Howell等[12-14]通过多重 PCR(multiplex PCR,m PCR)对副猪嗜血杆菌分子血清定型的方法与传统的血清分型方法结果有很高的一致性。蔡旭旺等[4]从全国十多个省市分离出32株Hps，对其中15株进行琼脂扩散血清分型，结果显示血清5型3株、血清4型4株、血清13型2株、血清12型2株，另外有4株不能进行分型。朱小宁等[5]从湖南分离到12株副猪嗜血杆菌，通过16S rRNA序列进化分析，发现其中11株菌株与血清5型同源性最高。【本研究切入点】对云南规模化养猪场疑似副猪嗜血杆菌病例样品，用TSA培养基进行细菌分离培养，观察细菌形态学、进行生化试验、观察卫星生长现象、进行特异性片段PCR扩增和对确定菌株的药敏试验，以及对菌株进行mPCR分子血清定型和16S rRNA序列分析。【拟解决的关键问题】为云南规模化猪场的副猪嗜血杆菌疫苗和敏感药物选用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 病料

采集云南省2个规模化猪场中疑似副猪嗜血杆菌感染，且具有典型病变的病猪内脏组织和心包液带到实验室进细菌分离。

1.2 主要试剂及菌株

胰蛋白大豆琼脂(Tryptic Soy Agar,TSA)胰蛋白大豆肉汤(Tryptic Soy Broth,TSB)为英国OXOID 公司产品；GoldViewTM核酸染料、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD或V因子)和新生小牛血清购自生工生物工程(上海)股份有限公司；药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司；特异性引物由华大基因合成； PCRmix、DL2000TM Marker均购自广州东盛生物科技有限公司；其他化学试剂均为国产分析纯产品。阳性对照副猪嗜血杆菌Nagasak株(CVCC3895，血清型5型)由中国兽医微生物菌种保藏管理中心购置、金黄色葡萄球菌由本实验室鉴定保存。

1.3 细菌分离培养

从疑似病例的肺脏、关节液、心包液中无菌取样，接种于TSA平板，37 ℃培养24～48 h，观察菌落形态，纯化后用TSB培养基培养保存。

1.4 染色镜检

挑取疑似菌落涂片，并进行革兰氏染色，然后于显微镜下观察细菌形态。

1.5 生化试验

首先在葡萄糖、乳糖、半乳糖、木糖、甘露醇、尿素酶等微量生化管中分别添加NAD(终浓度为10 μg·mL-1)，将1.3纯化培养的菌液加入各微量生化管，37 ℃培养24～48 h，观察结果。同时，吸取纯化培养菌液至洁净玻片，分别进行接触酶和氧化酶试验[15]。

1.6 “卫星生长现象”试验

在超净工作台内，挑取疑似菌落在鲜血琼脂平板上水平划线，再挑取金黄色葡萄球菌垂直于水平线划线，放置恒温恒湿培养箱于37 ℃培养24～48 h，看是否有“卫星现象”[16](靠近金黄色葡萄球菌菌苔的菌落较大，反之则菌落较小或无菌落生长)。

1.7 PCR检测

扩增副猪嗜血杆菌(HPS)特异性基因的引物序列引用自Angen等[17]，引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成(表1)，目的基因1090 bp。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。结束后，取10 μl扩增产物用1 %的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

1.8 multiple PCR分子血清定型

扩增副猪嗜血杆菌(HPS)15个型特异性基因和1个种特异性基因的引物序列引用自Howell等[12-14]，引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成(表2)。PCR反应体系：PCRmix 12.5 μl，引物混合物(型特异性引物∶种特异性引物=1∶0.25)3 μl，模板DNA 2 μl，DMSO 0.25 μl，超纯水7.25 μl，总体积25 μl。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，30个循环；68 ℃延伸5 min。结束后，取10 μl扩增产物用2 %的琼脂糖凝胶进行电泳检测，凝胶电泳时间90 min，以更好地分离扩增子。

表1 副猪嗜血杆菌(HPS)PCR特异性扩增引物

表2 副猪嗜血杆菌血清型基因扩增引物及产物大小

表3 细菌16S rRNA通用引物

1.9 16S rRNA序列分析

用细菌16S rRNA通用引物[18]扩增副猪嗜血杆菌16S rRNA基因序列(表3)，扩增产物与pESI-T载体链接，提取质粒送上海生工测序。应用MegAlign分析软件，对分离的DYJ20160901、CH20190501菌株16S rRNA 序列与GenBank上公布的国内外不同血清型菌株16S rRNA序列进行遗传进化分析，绘制系统进化树。

1.10 药敏试验

将副猪嗜血杆菌纯培养物均匀涂布于TSA平板上，用无菌镊子将各种药敏纸片分别平贴于培养基表面，37 ℃培养48 h后测量抑菌圈直径。根据杭州微生物试剂有限公司药敏试验纸片法的抑菌范围标准判定药物敏感程度。

2 结果与分析

2.1 病例剖检结果

通过对云南省2个规模化猪场疑似副猪嗜血杆菌病例进行病理解剖，发现2例病例均出现“绒毛心”(图1)、肺脏有纤维素性附着物，并且与胸膜黏

连(图2)，胸腔、腹腔有黄绿色混浊积液，后肢跗关节肿大，有黄色清亮渗出液。

2.2 分离培养菌落形态观察

从云南省2个规模化猪场病猪的肺脏支气管分离到2株细菌，分别为DYJ20160901、CH20190501，菌落在添加NAD及小牛血清的TSA平板上生长良好，形成针尖大小、圆形、半透明、光滑湿润的菌落(图3)。

2.3 革兰氏染色镜检结果

将纯化后菌落涂片，革兰氏染色后，显微镜下可见无芽孢和鞭毛、有荚膜的革兰氏阴性杆菌，菌体形态多样，短杆状多见，也有长丝状、球状(图4)。

2.4 生化培养特性

2株菌株均发酵葡萄糖、半乳糖，不发酵乳糖、木糖、甘露醇，接触酶试验为阳性，尿素酶、氧化酶试验为阴性，符合副猪嗜血杆菌生化特性(GB/T 34750-2017)。

2.5 “卫星生长现象”试验

通过“卫星生长现象”试验，发现2株菌株靠近金黄色葡萄球菌菌苔的菌落较大，远离金黄色葡萄球菌菌苔菌落较小，甚至无菌落生长(图5)。

2.6 PCR检测结果

应用副猪嗜血杆菌特异性引物对2株分离株进行PCR检测，通过凝胶电泳结果显示，2株分离株均有1090 bp的特异性条带，与预期结果相符(图6)。

2.7 multiple PCR分子血清定型

应用multiple PCR分子血清定型方法对DYJ20160901、CH20190501菌株进行分子血清定型，2株菌株均属于血清5/12型(图7～8)。

2.8 16S rRNA序列分析

使用DNA Star分析软件中的MegAlign分析软件，用Clustal W算法对分离的DYJ20160901、CH20190501菌株16SrRNA序列与GenBank上公布的国内外不同血清型菌株16S rRNA序列进行遗传进化分析，绘制系统进化树(图9～10)。结果显示2株菌株与Genbank中已公布的不同血清型HPS菌株同源性为97.3 %～99.6 %，DYJ20160901与Genbank登录号为FJ667952的血清5型菌株构成一个分支，同源性为99.1 %；CH20190501与Genbank登录号为AB078972的血清5型菌株构成一个分支，同源性为99.6 %。

2.9 药敏试验结果

从表4可见，2株菌株药敏试验高度敏感率达100 %的药物：强力霉素、大观霉素、头孢噻肟、氟苯尼考、头孢曲松钠，耐药率为100 %的药物：林可霉素。2016年分离的DYJ20160901株对喹诺酮类药物(恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星)均高度敏感，但是2019年分离的CH20190501株对以上喹诺酮类药物均出现了耐药性。

3 讨 论

副猪嗜血杆菌的培养对营养环境要求较高，除了需要胰蛋白大豆琼脂培养基外，还需要添加V因子或者NAD，以及胎牛血清，在添加时，需要注意无菌操作；副猪嗜血杆菌从猪肺脏支气管、心包积液、胸腔积液、关节液中均可分离得到，其中又以猪肺脏支气管较为容易分离，此外，需要注意的是采取的病料需在2 h以内分离细菌，则成功率较高。副猪嗜血杆菌在显微镜下形态多样，可为短杆状、杆状、球状、长丝状，这与副猪嗜血杆菌培养时间有关，早期培养基，副猪嗜血杆菌形态多以短杆状为主，陈旧培养基多以长丝状为主。

近年来，由副猪嗜血杆菌引起猪的浆膜炎和关节炎在中国各地猪场时有发生[4,19-21]，云南尚未见系统的研究报道，笔者从云南省规模化猪场分离到2株疑似菌株，经培养特性、形态观察、生化鉴定，以及PCR鉴定确定为副猪嗜血杆菌。由此说明，云南省存在副猪嗜血杆菌的流行。

药敏试验中发现，云南省2株分离株对强力霉素、大观霉素、头孢噻肟、氟苯尼考、头孢曲松钠高度敏感，对林可霉素出现耐药性，2016年分离的DYJ20160901株对喹诺酮类药物(恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星)均高度敏感，但是2019年分离的CH20190501株对以上喹诺酮类药物均出现了耐药性，分析原因，由于喹诺酮类抗生素具有抗菌谱广、杀菌力强、作用迅速、体内分布广泛等特点，被广泛用于预防和治疗畜禽疾病，养殖场长期使用喹诺酮类药物，使副猪嗜血杆菌对其出现了耐药性。薛国聪等[6]对广东地区分离的7株副猪嗜血杆菌药敏试验，结果显示其对氨苄西林、多粘菌素、庆大霉素高度敏感。张立宪等[6]对河南焦作地区分离的5株副猪嗜血杆菌进行药敏试验，结果显示其对丁胺卡那、洛美沙星、头孢噻肟、头孢噻呋较为敏感。刘俊伟等[8]对河南3株副猪嗜血杆菌药敏试验，结果显示其对左旋氧氟沙星高度敏感。周斌等[9]对华东地区13株副猪嗜血杆菌药敏试验，结果显示其对头孢类、阿莫西林等药物敏感。魏光河[10]对重庆渝东部分地区分离的3株副猪嗜血杆菌进行药敏试验，结果显示分离的3株疑似副猪嗜血杆菌菌株对头孢类、粘杆菌素类高度敏感；对四环素类、喹诺酮类、青霉素类药品明显耐药。由于副猪嗜血杆菌血清型较多，菌株间差异，敏感药物也有差异。临床药物的使用仍需要药敏试验做指导。这样可以避免盲目用药，减少抗生素残留，同时也降低养殖成本。

通过multiple PCR方法对分离的DYJ20160901、CH20190501菌株进行分子血清定型，显示两个菌株均为5/12血清型，将其16S rRNA序列与GenBank上公布的国内外不同血清型菌株16S rRNA序列进行遗传进化分析。结果显示2株菌株与Genbank中已公布的不同血清型HPS菌株同源性为97.3 %～99.6 %，DYJ20160901与Genbank登录号为FJ667952(日本Nagasak株)的血清5型菌株构成一个分支，同源性为99.1 %；CH20190501与Genbank登录号为CP001321(中国SH0165株)、AB078972(日本312株)、CP021644(美国29755株)、CP009237(中国KL0318株)的血清5型菌株构成一个分支，同源性为98.9 %～99.6 %。因此，两株菌株初步鉴定为血清5型副猪嗜血杆菌，与中国主要流行血清型一致[5]，与李福祥等在云南分离的YN-1株血清型一致[22]。Kielstein等[11]通过对SPF猪毒力测定，发现血清1、5、10、12、13、14型为高毒力菌株，血清2、4、15型为中等毒力菌株，血清3、6、7、8、9、11型为无毒力菌株。分离的2株菌株均来自“绒毛心、胸膜炎、腹膜炎、关节炎”等症状比较明显的病例，分离株毒力较强。不同血清型之间交叉保护性不强或无交叉保护作用，目前，尚无一种灭活疫苗可同时对付所有分离菌株[23]，该地区主要以血清5型副猪嗜血杆菌为流行菌株，因此，疫苗可以使用与分离株血清型一致、同源性较高的商品化菌株疫苗，这可为云南规模化猪场的副猪嗜血杆菌疫苗和敏感药物选用提供科学依据。

表4 分离株药敏试验结果

4 结 论

从云南规模化养猪场疑似病例样品中分离到的2株细菌(DYJ20160901、CH20190501)均为副猪嗜血杆菌血清5型；二者都高度敏感的药物是强力霉素、大观霉素、头孢噻肟、氟苯尼考、头孢曲松钠。