稳定性心绞痛患者血清miR-144、Ang1/2表达与冠状动脉侧支循环形成的相关性研究

李源繁，杨国杰，李栋博，李国栋，秦鹏，魏子寒

心绞痛是冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）的最常见表现形式之一，多由暂时性心肌缺血引起，以胸痛为主要特征[1]。冠状动脉（冠脉）侧支循环形成是慢性或反复性心肌缺血继发的一种代偿机制，良好的侧支循环形成有利于减轻狭窄或闭塞的冠脉缺血、缺氧，限制和缩小心肌梗死面积，改善心室功能，提高患者生存率[2,3]。冠心病患者冠脉侧支循环形成个体差异较大，可能与基础疾病、缺血时间及冠脉病变严重程度等有关，其具体机制尚不明确。微小RNA（miRNA）是一种高度保守的内源性非编码小RNA，多种miRNA与冠心病及相关性疾病发生发展密切相关，其中miR-144与冠心病严重程度、动脉粥样硬化斑块形成等有关[4-7]，但与稳定性心绞痛患者冠脉侧支循环形成的关系鲜有研究。血管生成素（Ang）是一种分泌性生长因子，与血管内皮细胞功能及炎症反应密切相关，其中Ang1可促进血管网的成熟，Ang2主要刺激新生血管形成[8]。因此本研究拟分析稳定性心绞痛患者血清miR-144、Ang1/2水平与冠脉侧支循环形成的关系，以探究其临床意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象选取2018年10月～2019年12月于郑州大学第一附属医院收治的行冠脉造影检查确诊的稳定性心绞痛患者134例，根据Rentrop分级分为侧支循环形成良好组（Rentrop分级≥2，n=76）及不良组（Rentrop分级≤1，n=58）。收集所有受试者基线资料，包括年龄、性别、基础疾病、血压、血脂、治疗史及血清标本等。本研究经本院的伦理委员会批准通过，所有受试患者或家属均签署知情同意书。

1.2 纳入与排除标准纳入标准：符合2007年中华医学会心血管病学分会指定的《慢性稳定性心绞痛诊断与治疗指南》[9]中稳定性心绞痛诊断标准；临床资料完整者；既往未接受过冠脉旁路移植术或经皮冠脉介入治疗（PCI）者。排除标准：合并严重肝、肾等脏器功能不全者；合并严重感染性疾病、血液系统传染性疾病及恶性肿瘤者；合并先天性心脏病及瓣膜性心脏病者；近3月内有急性心肌梗死病史者。

1.3 方法

1.3.1 Rentrop分级由2名经验丰富的心血管医师采用双盲法根据冠脉造影结果，采用Rentrop分级方法对侧支循环形成进行分级：无侧支循环形成为0级；病变远端分支显影为1级；病变远端血管部分显影为2级；病变远端血管完全显影为3级。其中0～1级为侧支循环形成不良；2～3级为侧支循环形成良好。

1.3.2 Gensini评分冠脉狭窄严重程度采用Gensini评分进行评价。Gensini评分系统按照美国心脏协会规定的冠脉血管图像分段评价标准[10]：正常，0分；≤25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，4分；76%～90%，8分；91%～99%，16分；100%，32分。狭窄部位不同，赋予系数不同：左主干×5；左前降支近段×2.5，中段×1.5，远段×1.0；第一对角支×1.0，第二对角支×0.5；回旋支近段×2.5，中段×1.5，远段×1.0；后降支×1.0；后侧支×0.5；右冠近、中、远后降支×1.0。同时根据病变支数分为单支组（前降支、回旋支或右冠任意1支发生病变，血管狭窄≥50%）；2支组（前降支、回旋支或右冠任意2支有病变，至少1支血管狭窄≥70%，左主干病变属2支组）；3支组（前降支、回旋支和右冠均发生病变，至少1支血管狭窄≥90%）。Gensini评分=（单处病变狭窄程度积分×相应系数）×总支数。

1.3.3 血清miR-144水平检测采用Trizol试剂（Takara公司）提取血清总RNA，用紫外分光光度计检测浓度及纯度。反转录得到cDNA，置于-20℃保存备用。采用实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，RTqPCR）扩增miR-144。引物由上海生工合成。miR-144上游引物序列（5′→3′）为：ATCCAGTGCGTGTCGTG，下游引物序列（5′→3′）为：TGCTTATACAGTATAGATG；内参U6上游引物序列（5′→3′）为：GCTTCGGCA GCACATATACTAAAAT，下游引物序列（5′→3′）为：CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT。20 μl反应体系：SYBR® Green Mix 10 μl，cDNA（50 ng/μl）1 μl，上下游引物（10 μM）各0.5 μl，ddH2O 8.0 μl。反应条件：95℃ 90 s；95℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 15 s，40个循环。采用2-△△CT法分析血清中miR-144相对表达水平。

1.3.4 血清Ang1/2水平检测采用酶联免疫吸附试验（ELLSA）检测血清Ang1/2水平，具体操作严格按照试剂盒说明书进行，试剂盒均由上海泽叶生物科技有限公司提供，货号分别为abx520454、abx511338。

1.4 统计学分析采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。计数资料以例（%）表示，采用χ2检验或Fisher确切概率法进行检验分析。计量资料符合正态分布者以均数±标准差（）表示，两两比较采用t检验；非正态分布计量资料以中位数（四分位数）[M（P25，P75）]表示，两两比较采用Mann-Whiteney秩和检验。采用Spearman法分析稳定心绞痛患者血清miR-144、Ang1/2水平与Gensini评分的相关性；绘制受试者工作特性曲线（ROC）分析血清miR-144、Ang1/2水平对稳定性心绞痛患者侧支循环形成不良的预测价值。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者一般资料比较侧支循环形成不良组与良好组稳定性心绞痛患者年龄、性别、吸烟史、糖尿病史、血脂异常、高血压、药物治疗史比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），表1。

2.2 两组患者Gensini评分及血清miR-144、Ang1/2水平比较与侧支循环形成良好组比较，不良组稳定性心绞痛患者血清miR-144、Ang1、Ang2水平降低，Gensini评分增加（P＜0.05），表2。

表1 两组患者一般资料比较

表2 侧支循环不良组与良好组患者血清miR-144、Ang1/2水平比较

2.3 稳定性心绞痛患者血清miR-144、Ang1/2水平的相关性Spearman相关性分析结果显示，稳定性心绞痛患者血清miR-144水平与Ang1、Ang2呈正相关（r=0.402、0.404，P＜0.05），图1。

2.4 稳定性心绞痛患者血清miR-144、Ang1/2水平与Gensini评分的相关性Spearman相关性分析结果显示，稳定性心绞痛患者血清miR-144、Ang1、Ang2水平与Gensini评分均呈负相关（r=-0.707、-0.401、-0.454，P＜0.05），图2。

图1 稳定性心绞痛患者血清miR-144与Ang1/2水平的相关性

图2 稳定性心绞痛患者血清miR-144（A）、Ang1（B）、Ang2（C）水平与Gensini评分的相关性

2.5 血清miR-144、Ang1/2水平对稳定性心绞痛患者冠脉侧支循环形成不良的预测价值血清miR-144、Ang1、Ang2水平预测稳定性心绞痛患者冠脉侧支循环形成不良的曲线下面积（AUC）分别为0.907（95%CI：0.851～0.962）、0.698（95%CI：0.608～0.788）、0.728（95%CI：0.454～0.812），截断值分别为0.644、3.082 ng/ml、10.753 ng/ml，灵敏度分别为86.20%、98.30%、94.80%，特异度分别为89.50%、56.50%、46.10%。三者联合检测的AUC为0.915（95%CI：0.858～0.967），灵敏度及特异度分别为93.10%、90.80%，图3。

图3 血清miR-144、Ang1/2预测稳定性心绞痛患者冠脉侧支循环形成不良的ROC曲线

3 讨论

良好的冠脉侧支循环形成是缺血心脏病的重要保护机制，目前评价侧支循环形成的方法主要为冠脉造影，但因其为有创性，存在一定局限，因此寻找简便、快捷、准确的血清学生物指标预测稳定性心绞痛患者冠脉侧支循环形成对患者临床诊疗及预后评估具有重要意义。

研究发现，miR-144与冠心病、心肌细胞结构及功能密切相关。miR-144消融可增加波形蛋白的表达和动脉粥样硬化斑块的形成[5]，miR-144信号通路缺失可阻断心肌梗死后细胞外基质重构，导致心功能恶化[11]。Gao等[12]研究报道，慢性硬膜下血肿的血肿来源外泌体通过miR-144-5p促进异常血管生成并抑制血肿吸收，推测miR-144可能与冠脉新生血管形成有关。本研究发现，与侧支循环形成良好组比较，不良组患者血清miR-144水平显著降低，提示miR-144水平降低可能与稳定性心绞痛发生及其冠脉侧支循环形成不良有关。

Ang在血管及动脉生成中起重要作用，Ang1和Ang2参与血管的成熟和形成，Ang1通过保持血管完整性来防止血管重构，在血管生成过程中可促进其出芽及分支[13,14]。Demir等[15]研究报道，与侧支循环形成良好患者比较，侧支循环形成不良的稳定性冠心病和心力衰竭患者Ang2水平较低，而Ang1水平较高。赵松峰等研究报道，人血管瘤内皮细胞凋亡与血管内皮生长因子（VEGF）及Ang2表达下调有关。本研究发现，与侧支循环形成良好组比较，侧支循环形成不良组稳定性心绞痛患者血清Ang1、Ang2水平均显著降低，与Demir等[15]文献报道结果不一致，推测可能与疾病发展时期不同及选择患者异质性有关，提示Ang1/2水平降低可能与稳定性心绞痛患者冠脉侧支循环形成不良有关。基于miR-144、Ang1、Ang2均与血管生成有关，本研究采用Spearman分析其相关性，结果发现，稳定性心绞痛患者血清miR-144水平与Ang1、Ang2水平均呈正相关，提示miR-144、Ang1、Ang2可能协同促进稳定性心绞痛患者冠脉侧支循环形成。另外血清miR-144、Ang1、Ang2水平与Gensini评分均呈负相关，提示血清miR-144、Ang1、Ang2水平可能与稳定性心绞痛患者冠脉狭窄程度有关，监测三者水平可能对患者预后评估有一定指导价值。

本研究进一步进行ROC曲线分析，结果发现，血清miR-144、Ang1、Ang2水平预测稳定性心绞痛患者冠脉侧支循环形成不良的AUC分别为0.907、0.698、0.728，截断值分别为0.644、3.082 ng/ml、10.753 ng/ml，灵敏度分别为86.20%、98.30%、94.80%，特异度分别为89.50%、56.50%、46.10%。三者联合检测的AUC为0.915，灵敏度及特异度分别为93.10%、90.80%，提示联合血清miR-144、Ang1、Ang2可显著提高预测稳定性心绞痛患者冠脉侧支循环形成不良的特异度，更具临床价值。

综上所述，血清miR-144、Ang1/2水平与稳定性心绞痛患者冠脉狭窄严重程度呈负相关，三者联合检测可显著提高预测侧支循环形成不良特异度，有潜力成为预测冠脉侧支循环形成的生物标志分子。但本研究样本量少，选择范围局限，存在不足；关于miR-144与Ang 1/2在稳定性心绞痛患者冠脉侧支循环形成的具体作用机制，有待进一步深入探究。