p16/Ki-67双染在高级别宫颈上皮内瘤变诊断中的应用价值

杨 旎,陈 飞,孔令华,霍 霄,沈 铿

(中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院妇产科,北京 100730)

宫颈癌发病率居全球女性癌症发病率第二位[1],中国女性生殖系统恶性肿瘤首位[2]。近年来,世界卫生组织(world health organization,WHO)将宫颈癌预防作为优先事项[3],其病死率明显下降,但资源匮乏地区由于缺乏合适的筛查计划,仍然面临极大的负担。因此,HPV的免疫,筛查和治疗宫颈癌仍至关重要[4]。目前临床使用的筛查手段并不完美,高危型人乳头瘤病毒(high risk human papillomavirus,hrHPV)检测误诊率高,许多妇女接受了不必要的检查与治疗;细胞学筛查准确性低、结果可重复性差、医生工作负荷过重。多项研究发现,宫颈癌的发生、发展及预后与肿瘤抑制基因p16和增殖细胞核抗原Ki-67有关[5]。Schmidt等[6]发现,若在一个细胞中同时检测到p16和Ki-67共表达,则高度提示有宫颈高级别上皮内瘤变的存在,是近年来一种较新的宫颈病变检测手段。宫颈癌或癌前病变的细胞发生形态学改变通常较晚,在不依赖于细胞形态,结合细胞学p16/Ki-67双染检测,可提高宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)2+的检出率,减少创伤性检查。本文比较了细胞学p16/Ki-67双染检测和hrHPV检测对ASCUS患者的分流作用与诊断效能,判断p16/Ki-67双染作为生物标记物在病理诊断中的价值。

1 材料与方法

1.1 病例与标本 收集2019年4月1日到2019年5月30日在北京协和医院妇产科门诊收治的52例细胞学诊断为无明确意义的非典型鳞状细胞(atypical squamous cells of undermined significance,ASCUS),同时行hrHPV检测,并有宫颈组织病理学检查结果的患者信息,将其剩余宫颈上皮脱落细胞标本进行p16/Ki-67免疫细胞化学双染检测。收集2017年3月1日至2019年3月1日在北京协和医院进行阴道镜、锥切或全子宫切除的153例宫颈组织学标本,进行p16/Ki-67组织学双染检测,由2名病理学家进行判读及评分。从病历系统获取患者病史及随诊信息。纳入标准:年龄大于20岁;有性生活史,未妊娠;无子宫颈切除术史;细胞学双染组患者经液基细胞学检查(liquid-based cytology test,LCT)确诊为ASCUS,遵循TBS诊断标准[7]。排除标准:妊娠期或哺乳期妇女;参与其他临床研究者。本研究已获得伦理委员会审查。

1.2 实验方法 细胞学双染:宫颈细胞学采用Thinprep(Hologic公司,Massachusetts,USA)液基薄片法,hrHPV检测采用Cobas4800检测系统(Roche诊断产品公司,Newjersey,USA)。将收集的宫颈脱落细胞剩余标本在BD Sure Path载玻片上制备一张薄片,采用全自动免疫组化分析仪(型号为Benchmark GX)进行染色(Roche诊断产品公司,Newjersey,USA),试剂盒为Roche诊断产品公司的配套试剂CINtec PLUS。组织学双染:将组织蜡块制片,采用全自动免疫组化分析仪进行染色(Roche诊断产品公司,Newjersey,USA),试剂盒为Roche诊断产品公司的配套试剂p16/Ki-67组织学双染试剂。整个操作过程严格按说明书进行。

1.3 诊断标准 细胞学双染:p16定位于胞质,显棕色;Ki-67定位于胞核,显红色。当满足1个细胞质显棕色(p16),同时胞核显红色(Ki-67),则结果为双染阳性,无需考虑细胞形态,单独显色或不显色为阴性[8]。细胞学检查采取巴氏染色法,遵循TBS诊断标准[7]。组织学双染:使用2019美国阴道镜检查与宫颈病理学会(ASCCP)宫颈病理指南为诊断标准,结合相应的HE染色结果,由2名病理医生在不了解患者病历信息情况下进行阅片,根据表1的评分系统[9],将组织学双染片进行评分。

表1 组织学双染评分系统

1.4 统计学处理 采用SPSS 26.0统计软件包。计数资料采用χ2检验。计量资料比较采用方差分析。计算p16/Ki-67双染检测及hrHPV检测方法的灵敏度、特异度、总符合率、阳性预测值、阴性预测值及Kappa系数。α=0.05为检验水准。

2 结 果

2.1 细胞学双染 根据《WHO女性生殖器官肿瘤学分类(第4版)解读》[10],CIN被分为低级别上皮内瘤变(low-grade squamous intraepithelial lesions,LSIL)和高级别上皮内瘤变(high-grade intraepithelial neoplasia,HSIL)。《中国子宫颈癌筛查及异常管理相关问题专家共识(二)》[11]指出,CIN2中的p16/Ki-67双染阴性的患者仍归为LSIL。为与临床相统一,本部分仍把HSIL分为CIN2和CIN3,进一步观察p16/Ki-67双染与hrHPV检测对ASCUS患者的诊断效能。52例细胞学诊断为ASCUS的患者,其中组织病理金标准诊断结果正常患者32例,CIN1患者9例,CIN2患者3例,CIN3患者5例,宫颈癌患者3例。不同病变程度患者hrHPV和p16/KI-67双染阳性率的比较,见表2。p16/Ki-67双染的阳性率与病变程度大致呈正比,特别是在正常和LSIL患者中,p16/Ki-67双染比hrHPV检测符合度更高(P=0.6963)。

表2 不同病变程度hrHPV、p16/Ki-67双染阳性率

若以hrHPV阳性或p16/Ki-67双染阳性作为ASCUS患者的阴道镜分流标准,两者分别会使42例(80.8%),27例(51.9%)患者转诊阴道镜检查,p16/Ki-67双染可减少28.9%的阴道镜分流。分别计算hrHPV和p16/Ki-67双染在检出CIN2+的诊断效能,见表3。两者的灵敏度均为90.91%,但p16/Ki-67双染检出CIN2+的特异度、总体符合率、阳性预测值、阴性预测值和Kappa系数均优于hrHPV检测。

表3 CIN2+患者hrHPV,p16/Ki-67双染诊断效能的比较

2.2 组织学双染 153例患者中,病理诊断结果正常患者8例,LSIL患者46例,HSIL患者59例,宫颈微小浸润癌(microinvasive carcinoma,MIC)患者38例,宫颈癌患者2例。p16/Ki-67双染的阳性率与病变程度大致成正比,见表4。

表4 组织学双染评分结果

3 讨 论

近年来hrHPV检测在宫颈癌筛查中所占的角色越来越重要,已被一些国家作为初筛手段纳入宫颈癌筛查体系,但超过90%的HPV感染可自然消退[12]。同时,病理细胞学医生缺乏,诊断结果可重复性差,制片质控参差不齐,也限制了其发展。p16/Ki-67双染检测操作简单、系统,无内源性生物素干扰,易于观察,其原理依据为p16蛋白是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂,其过表达提示细胞处于细胞周期的阻滞期。Ki-67反映细胞周期进展及增殖活跃,其阳性提示宫颈细胞处于细胞周期的增殖期。正常生理状态下,p16和Ki-67的表达相互制约,达到一种动态平衡的状态,不会同时出现在同一个细胞中,二者共表达提示细胞周期调控失调[13]。本研究结果进一步验证p16/Ki-67双染有助于识别病变细胞。

hrHPV阳性是临床上常见的筛查异常结果,结合细胞学结果许多患者的处理流程是转诊阴道镜。Liu等[14]研究表明,平均随访2年,仅有2.4%细胞学阴性且 hrHPV阳性患者进展为 CIN2。Yang等[15]研究细胞学阴性且hrHPV阳性患者3年CIN3+累积风险为6.8%,由此可见,以hrHPV阳性作为宫颈癌筛查方法或分流手段会造成过高的阴道镜转诊率,造成了大量的医疗资源浪费。本研究结果显示,p16/Ki-67双染的阳性率与病变程度大致呈正比,特别是在CIN2-的患者中,比hrHPV检测结果符合度更高,降低假阳性率,使患者避免不必要的有创检查或治疗。本研究结果显示,hrHPV和p16/Ki-67双染对检出CIN2+的敏感性相同,但p16/Ki-67双染误诊率低,与病理金标准符合率更高,结果与Peeters等[16]荟萃分析结果相符;并且,p16/Ki-67双染读片简单易行,对单纯细胞学读片也有辅助作用,对于医疗资源不发达、设施不完善的贫困偏远地区的宫颈癌筛查推进有十分重要的意义。

本研究比较了不同组织病变程度下组织学p16/Ki-67双染结果,并进行了评分,以探讨p16/Ki-67双染在判断宫颈癌前病变患者转归方面的作用,以及p16/Ki-67双染是否可作为宫颈病变病理诊断辅助生物标记物。本研究发现,p16/Ki-67双染阴性患者的病理结果优于双染阳性的患者。本研究显示,p16/Ki-67双染与病理金标准有很好的符合度,其随着病变程度加重双染阳性率升高。因此,对于p16/Ki-67双染阳性的患者,临床上应重点关注,注意运用多学科进行排查,密切随访,及时预测和发现HSIL等病变,做到早诊断、早治疗。

p16/Ki-67双染全部染色过程在全自动免疫组化仪内进行,结果更加稳定可靠,无需占用医生工作时间,可提高工作效率,缩短病理报告发放周期。虽然p16/Ki-67双染有着较好的病变符合率,提高了CIN2+病变的检出率,但仍存在一定的漏诊和误诊,这可能由于实验过程中制片质量与方法不稳定,使双染片中存在细胞稀疏或成团,从而影响判读结果;同时因为阅片经验不足,可能导致误判。为提高制片质量,可从以下几个方面进行改进:(1)制片前去除标本中的血液黏液,使背景更清晰。(2)宫颈细胞存放在液基细胞保存液中不宜超过6周,以防止抗原丢失。(3)双染实验应在干燥液基细胞学玻片制备好后3天内进行。(4)注意试剂保质期极仪器定期维护。

综上所述,p16/Ki-67双染可提高CIN2+的诊断效能,其作为一种宫颈筛查分流手段,可有效减少阴道镜转诊率,同时具有简便易重复、客观高效等优点。p16/Ki-67双染作为一种生物学标记物,与组织病理学有很好的符合度,可辅助病理诊断以及对临床转归的判断。