江苏地区5776例孕妇脊髓性肌萎缩症携带者筛查及产前诊断*

张菁菁,王玉国,马定远,刘 刚,罗春玉,胡 平,许争峰

[南京医科大学附属妇产医院(南京市妇幼保健院)遗传医学中心,南京 210004]

脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy,SMA)是一种常见的致死性神经肌肉遗传病,该病临床表现差异较大,主要表现为进行性、对称性肌无力和肌萎缩的神经变性疾病[1]。根据患者起病的年龄及严重程度分为4型(I～IV型)。I型为婴儿型,病情最严重,约占总病例的45%,患儿出生后6月内发病,大多数患儿2岁内死于呼吸衰竭。II型为中间型,约占40%,出生后6～18个月发病,丧失独坐或独走的能力,多数只能活到成年。III型和IV型属于青少年型和成人型,患者随年龄的增长逐渐丧失行走能力[2]。

SMA是一种常染色体隐性遗传病,其发病概率为1/5000～1/10000,各个国家和地区群体携带率不同,约为1/35～1/85[3]。SMA的致病基因是位于5号染色体长臂的运动神经元生存基因(survival motor neuron,SMN),SMN基因有两个高度同源的SMN1和SMN2基因,两者编码区仅在外显子7上相差一个碱基,同源性＞99%,它们均编码 SMN蛋白[4]。SMN1基因编码有功能的全长SMN蛋白,而SMN2基因仅能表达少量(大约10% ～20%)全长有正常功能的SMN蛋白。所以,SMN1基因为SMA的致病基因,而SMN2基因作为修饰基因与SMA表型的严重程度相关[5]。目前的研究显示,约95%的SMA患者是由于SMN1基因第7外显子缺失或第7、8外显子同时缺失致病,其余5%是由于SMN1基因的缺失突变和点突变同时存在致病[6-7]。

SMA症状严重,致死率高且致病基因较明确,针对SMA携带者的筛查很早就受到国内外学者的关注。2008年ACMG(美国医学遗传学会)[8]建议,无论种族,SMA携带者筛查应被提供给所有夫妇。2017年ACOG(美国妇产科学会)[9]也建议,所有正在考虑怀孕或已怀孕的女性均应进行SMA携带者筛查。本研究应用荧光定量PCR技术对江苏省5776例孕妇进行SMA携带者筛查,首次明确本地区的携带者频率,并对高风险胎儿进行产前诊断,以减少SMA患儿的出生。

1 资料与方法

1.1 资料来源 选取2019年8月至2020年7月在南京市妇幼保健院遗传医学中心就诊的16549例表型正常的孕期女性,对其进行SMA携带者筛查的宣教,其中5776例孕妇自愿接受SMA携带者筛查,接受率约为34.9%。孕妇年龄17～47岁,平均(29.9±4.6)岁,孕周11～22周,平均(16.5±1.9)周,且否认SMA家族史和生育史。本研究符合医学伦理审查委员会所制定的标准并获得批准(宁妇伦字KY-004号),所有接受筛查的孕妇均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取 使用EDTA抗凝管采集自愿参加筛查的孕妇外周静脉血2mL,对于需进行产前诊断的孕妇于孕18～24周采集羊水10mL,采用 DNA提取试剂盒(QIAamp,QIAGEN公司,德国)提取外周血或羊水基因组DNA,Nanodrop分光光度计(ThermoFisher,美国)测定DNA浓度,并且把 DNA浓度稀释在 10～20ng/μL,OD260nm/OD280nm比值在1.8～2.0之间。

1.2.2 实时荧光定量PCR检测 运用SMN1外显子缺失检测试剂盒(上海五色石医学研究股份有限公司,中国)对SMN1基因拷贝数进行检测。该试剂盒采用MGB探针实时多重荧光定量PCR的方法,使用人RPP40基因作为内标基因,分别对SMN1基因第7外显子和第8外显子进行扩增并对拷贝数进行相对定量检测。反应设空白对照品,缺失对照品和3个梯度的正常对照品DNA,每个样本分两个反应管(E7和E8反应)。每个反应20μL包含反应液2.0μL,主反应混合液10μL,反应辅助液1.2μL,去离子水2.8μL,模板DNA 4.0μL。反应体系配置完成后,振荡均匀,2000r/min离心10s,再放入ABI StepOne荧光定量PCR仪(TermoFisher,美国)。PCR扩增反应:95℃热启动10min后,95℃变性15s,58℃退火与延伸40个循环,实时收集目的基因FAM和内标基因VIC荧光信号。首先分别计算各个梯度对照品目的基因与内标基因间的ΔCt值,ΔCt=Ct_FAM-Ct_VIC,再计算出正常对照品3个梯度的ΔCt值的平均值,记为ΔCt_a,其次分别计算待测样本目的基因与内标基因的ΔCt值,记为ΔCt_s,最后得出 ΔΔCt=ΔCt_s-ΔCt_a。 ΔΔCt＞0.8 时,判定 E7 或E8 纯合缺失;-0.5＜ΔΔCt＜0.5 时,判定杂合性缺失;ΔΔCt＜-0.6时,判定未见缺失。

1.2.3 多重连接依赖探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA) 利用MLPA P460试剂盒(荷兰MRC,荷兰)对于SMN1基因E7和E8外显子拷贝数变异进行验证。MLPA P460试剂盒中探针包含SMN1基因E7和E8以及SMN2基因E7,经变性、杂交、连接以及扩增后,产物通过ABI3500基因分析仪(ThermFisher,美国)进行检测,得到的数据用Coffalyser V8.0软件分析(http://www.mlpa.com/coffalyser)。目标片段超过30%的增加或减少分别判定为目标外显子的重复或缺失。

2 结 果

5776例孕妇血样中,E7单拷贝的人群有100例(100/5776,1.73%),其中E8单拷贝有93例,E8双拷贝有7例,没有E8大于双拷贝的;E7双拷贝的人群有5356例(5356/5776,92.73%),其中E8单拷贝有28例,E8双拷贝有5216例,E8大于双拷贝有112例;E7大于双拷贝有 320例(320/5776,5.54%),其中没有E8单拷贝,E8双拷贝有14例,E8大于双拷贝有306例(表1)。

表1 5776例孕妇的SMN1基因外显子7和外显子8的拷贝数

共筛查到100例孕妇(100/5776,1.73%)携带SMN1基因E7单拷贝或E7和E8单拷贝,其中E7和E8单拷贝的孕妇有93例,单纯E7单拷贝有7例,携带者频率为1∶58,即人群中每58例中有1个SMA携带者。对100例携带者进行充分的遗传咨询后,其中91例(91/100,91%)配偶自愿接受SMA筛查,最终有3对夫妇均为SMA携带者,并且对3例高风险胎儿进行了产前诊断,结果提示这3个胎儿均为SMN1基因单拷贝,即SMA携带者(图1)。

图1 SMA筛查和产前诊断流程

3 讨 论

对于各种遗传病携带者的筛查,在世界范围内已开展了近三十年。早在1969年,对犹太人的家族性黑蒙性痴呆进行携带者筛查,有效降低了该疾病在犹太人群中的发病概率。随后又开展了囊性纤维化、血红蛋白病、脆X综合征等疾病的携带者筛查[10]。2008年美国医学遗传学会(ACMG)的指南提出[8],符合以下条件的疾病适合于携带者筛查:(1)疾病的临床表现严重;(2)在人群中具有较高的携带者频率;(3)检测技术具有较高的特异性和敏感性;(4)适合于进行产前诊断;(5)可进行遗传咨询。SMA完全符合以上所有条件,所以ACMG[8]和ACOG[9]均建议备孕或孕期女性应进行SMA携带者筛查。

本研究对16549例孕妇进行SMA筛查的宣教,其中5776例孕妇自愿接受SMA筛查,接受比率为34.9%。相较于2011年报道的台湾地区的接受率(10.6%),有了大幅度的提高[11],但是比其他国家的接受率低得多。Prior等[12]报道,美国人群中98.7%接受SMA携带者筛查[12]。Ben等[13]报道,以色列人群中93%要求进行SMA携带者筛查。分析国内接受程度比较低的原因主要与人群对于SMA疾病不了解,且没有相关家族史相关,其次与费用相关。因此,加强SMA筛查的宣教以及政府机构的相关政策的实施将有利于提高SMA筛查的人群接受程度。

中国人群中首次大样本量的SMA筛查是在中国台湾地区,2005年至2009年共筛查台湾地区10万余例孕妇,共检出2262例SMA携带者,该地区的携带者频率为1∶48[11]。2013年[14]上海地区报道了4719例孕妇的携带者筛查,该地区的携带者频率为1∶52。近两年,广西[15]、陕西[16]及云南地区[17]分别报道了本地区的携带者频率,分别为1∶81、1∶54和1∶49。本研究首次对江苏地区5776例孕妇进行SMA携带者筛查,共发现100例SMA携带者,携带者频率为1∶58。根据已有文献报道,国内除了广西地区报道的携带者频率较低外,其余地区的携带者频率均相近。

每一种遗传病的携带者筛查都存在一定的残余风险,对于SMA筛查,人群中有少量携带者是普通的筛查方案无法检出的,包括SMN1基因“2+0”型、“1+1D”和“2+1D”。即一条染色体上有两个SMN1基因,而另一条染色体上没有SMN1基因或SMN1基因点突变;或者,一条染色体上有一个SMN1基因,而另一条染色体上SMN1基因点突变[18]。如果夫妇双方有一方为SMA携带者,另一方虽然SMN1基因为双拷贝,但不能排除以上几种可能性,所以在筛查咨询中要关注残余风险的存在。

建议标准化的SMA筛查流程对于临床开展该项目有着至关重要的作用。(1)对孕妇人群进行宣教,让孕妇充分了解SMA疾病的病因、临床表现和严重程度,提高筛查接受程度;(2)签署知情同意书,告知该检测的目的、方法及局限性,孕妇自愿接受该项筛查;(3)出具报告,对于SMN1基因E7或E7/8单拷贝人群,即SMA携带者,通知配偶进行SMA筛查;(4)如果夫妇双方均为SMA携带者,则建议遗传咨询与产前诊断门诊就诊,对于高风险胎儿进行SMN1和SMN2基因检测,SMN1基因如果为零拷贝,则可根据SMN2基因的拷贝数推测胎儿出生后的临床表现。近年来SMA的治疗手段有了长足的进展[19],特别是2019年首个SMA治疗药物诺西那生钠的国内上市。SMA治疗方案在遗传咨询中不应被忽略,应将检测结果、临床表现及治疗方案充分告知夫妇双方。在整个筛查流程中,完善的遗传咨询、全面的风险评估以及充分残余风险告知尤其重要。