超声辅助提取对铁观音茶渣蛋白功能特性的影响

我国茶叶资源丰富，茶叶经过饮用或者浸提后残余的废渣叫做茶渣，约占成品茶量的10%[1].目前，大多茶渣被作为肥料或饲料使用[2-3]，附加值较低，因此，废弃茶渣的高值化利用成为亟待解决的行业难题.茶渣中一般含有15%～30%的蛋白质，且氨基酸组成与大豆蛋白非常相似，具有较高的营养价值[4].因此，将茶渣中蛋白资源进行回收利用在食品领域具有很好的应用前景.

目前，有关茶蛋白的研究主要集中在提取工艺优化以及功能特性的提高.现有报道表明，碱酶复合提取法[5-6]、碱性电解水耦合酶法[7]及反向微乳提取法[8]在提取率及产品纯度上明显优于传统的碱溶法及酶法，而微波[9]、超声[10]、冻融[4,11]等辅助提取方法的应用均可不同程度地提高蛋白得率，对其功能特性也有着不同的影响.Ishmael等[10]报道超声辅助对醇水-戊聚糖复合酶提取的茶渣蛋白溶解性、乳化性、起泡性及泡沫稳定性与为采用超声辅助相比具有显著提高.此外，酶解在提高蛋白提取率的同时也能有效改善蛋白的功能特性，如王洪新等[12]对茶蛋白进行水解改性，使茶叶蛋白质的溶解性、吸水性、起泡性、乳化性和凝胶性大大改善，改性后的茶蛋白质主要功能性质可与大豆分离蛋白媲美.Li等[13]报道茶籽蛋白水解物的DPPH自由基清除率随水解时间的延长逐渐升高，最后达到最高值.蛋白结构中氨基酸种类、含量及序列不同，酶解、超声等辅助提取对其功能特性影响也有差异，例如同样的提取方法得到的绿茶蛋白泡沫稳定性和乳化活性要高于乌龙茶和红茶[14]，而目前有关才超声辅助碱酶法对铁观音茶渣蛋白的提取及功能改性鲜有报道.本文以铁观音茶渣为原料，研究超声预处理对碱酶法提取的茶渣蛋白的功能特性及抗氧化活性的改性作用，以期为铁观音茶叶乃至其他半发酵茶加工副产物的高值化应用提供技术参考.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

铁观音加工过程中产生的茶渣，福建安溪铁观音集团股份有限公司提供；玉米油，嘉里粮油(中国)有限公司；截留分子量500 Du透析袋，Viskase公司.碱性蛋白酶(21 450 u)诺维信(中国)生物技术有限公司；1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)，2′-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)均购自美国Sigma-Aldrich公司.

1.2 仪器与设备

FW-100型天津泰斯特仪器高速万能粉碎机，PB-21型德国赛多利斯酸度，R30A型德国弗鲁克科技电动搅拌器，K9840型中国海能仪器自动凯氏定氮仪，GL-20G型上海安亭高速冷冻离心机，FD-1A-80型北京博医康冷冻干燥机，SCIENTZ-250C型宁波新芝生物超声萃取仪，UV-1200型上海美谱达紫外可见分光光度计，T18D-S25数显型德国IKA高速分散器等.

1.3 实验方法

1.3.1 原料预处理 铁观音茶渣先在45 ℃下热风干燥2 h，后粉碎过80目筛备用.

1.3.2 茶渣蛋白(tea rsidues protein,TRP)提取 (1)超声辅助碱酶提取：在Shen等[15]及李圆圆等[16]的提取方法基础上略有改动，按1∶35的料液比加入蒸馏水，在一定条件下进行超声处理.超声结束后，用2 mol/L NaOH溶液调节至pH 10，加入体积分数为2.5%的液体碱性蛋白酶(21 450 u)，60 ℃下搅拌浸提2 h，提取过程中用1 mol/L NaOH严格控制在pH 10保持恒定.提取结束后在100 ℃水浴中灭酶10 min，冰浴冷却至室温后离心(7 000 r/min，20 min)，所得上清液为TRP粗提液.参考Cui等[6]方法，凯氏定氮测定茶渣及TRP提取液中蛋白质含量，蛋白提取率为上清液中蛋白的总含量与茶渣中总蛋白含量的百分比.

(2)初步分离：在25 ℃下向提取液中缓慢加入硫酸铵，使硫酸铵最终达到100%饱和度，继续搅拌10～20 min，置于4 ℃冰箱中过夜后，加入到离心管中离心(3 000 r/min，30 min)，收集蛋白质沉淀.将含硫酸铵的蛋白质沉淀复溶后装在透析袋中，置4 ℃冰箱内透析过夜，中间每隔4 h换一次透析缓冲液(0.05 mol/L pH 7.0磷酸盐)，直到用氯化钡溶液检查透析液无白色沉淀后，结束透析.将透析袋中溶液冷冻、冻干后得到TRP，供后续测试使用.

1.3.3 超声辅助提取工艺优化 (1)单因素实验：基本工艺条件为超声功率300 W，温度40 ℃，时间30 min，在此条件下以TRP提取率为考察指标，控制单一变量，选取超声功率为200、300、400、500 W，超声温度为30、40、50、60 ℃，时间为 30、40、 50、60、70 min进行单因素实验.(2)响应面实验设计：在单因素试验的基础上，应用响应面分析软件Design-Expert 10.0.7中Box-Benhnken中心组合试验原理，构建三因素三水平的模型，对试验数据进行优化，最终确定出最佳超声辅助提取工艺.

1.3.4 功能特性的测定 (1)溶解性:参考Benelhadj等[17]实验方法:

(2)乳化活性：参考Ren等[14]实验方法,乳化性和乳化稳定性公式为：

其中：T=2.303,N为稀释倍数250,C是乳化液形成前蛋白质水溶液中蛋白质浓度(g/mL),Φ为乳化液中油的体积分数(0.25)，A0为20 μL的乳状液与5 mL 质量浓度为0.1% 的SDS溶液均匀混合后在500 nm处的吸光值，A30为乳状液静置30 min后采用相同的方法取样测定的吸光值.

(3)起泡性：参考杜琛等[18]实验方法.记录均质后泡沫面高度为V0，静置30 min后再次记录泡沫面高度，记为V30.起泡性与泡沫稳定性公式为：

1.3.5 抗氧化性的测定 (1)DPPH·清除力测定：参考Yang等[19]实验方法.实验组吸光值记为A1，以去离子水作为参比，吸光值记为A0，对照组吸光值记为A2.以Vc的DPPH·清除能力作为参照.

茶渣蛋白水解物对DPPH·的清除率为:

(2)ABTS+·清除力：参考Roberta等[20]的实验方法.实验组吸光值记为A1，以去离子水作为参比，吸光值记为A0，对照组吸光值记为A2.以Vc的ABTS+·清除能力作为参照.

茶渣蛋白水解物对ABTS+·的清除率为:

1.3.6 数据统计分析 所有实验重复3次，SPSS Statisics 22.0 进行数据分析，采用LSD测试进行数据中的显著性分析，P<0.05表示差异有统计学意义，采用sigmPlot 10.0 绘图，字母不同表示差异有统计学意义(P<0.05);采用Probit进行IC50分析.

2 结果与分析

2.1 超声辅助提取工艺优化

2.1.1 单因素实验 单因素对铁观音茶渣蛋白提取率的影响见图1.如图1(a)所示，TRP提取率随超声功率的增大先升高后下降，前后间差异均有统计学意义(P<0.05)，在300 W时达到最大值.这可能是随着超声功率的增大，空穴效应增加，有利于细胞的破碎和蛋白的溶出，但过大的功率可能蛋白变性沉淀从而降低蛋白的提取率[21].超声温度的单因素实验见图1(b)，实验范围内随温度升高，TRP提取率升高，前三个温度条件下提取率差异有统计学意义(P<0.05)，当到50 ℃后继续升高温度，其提取率差异无统计学意义，因此，50 ℃为最佳的温度.图1(c)显示，随超声时间的增加，TRP提取率逐渐升高，在60 min时达最大值，继续延长时间，其提取率下降，与70 ℃与60 ℃提取率相比差异有统计学意义(P<0.05).这可能是过长的超声处理造成蛋白变性的结果[21].因此选择最佳时间为60 min.

图1 超声功率、温度和时间对铁观音茶渣蛋白(TRP)提取率的影响Fig.1 Effect of ultrasonic power,temperature and time on the extraction rate of Tieguanyin tea residue protein (TRP)

2.1.2 响应面分析 根据单因素实验结果，选取超声功率(A)，温度(B)，时间(C)三个因素，以TRP提取率为响应值，采用Box-Benhnken中心组合试验进行超声辅助提取条件优化，试验因素与水平见表1，试验方案与结果见表2.通过Design-expert 10.0.7软件对结果进行拟合回归，得方程为：

R=73.43+0.005A+0.34B+0.084C-0.21AB-0.17AC-0.000 862 5+0.61BC-3.68A2-1.53B2-1.82C2.

表1 响应面试验因素及水平Tab.1 Factors and levels of response surface methodology experiment

表2 响应面实验结果Tab.2 Results of response surface methodology experiment

表3 回归模型方差分析Tab.3 ANOVA for response surface quadratic model

据此,优化所得最佳工艺条件为超声功率299.623 W，温度51.189 ℃，时间为60.427 min，在此条件下TRP提取率预测值为73.45%.考虑到实际操作的便利，确定超声功率300 W，温度52 ℃，时间为60 min，实际测得平均值为73.22%，与理论值非常接近，说明该方程与实际情况拟合较好，验证了所建模型的正确性.同时，直接碱酶法的TRP提取率为69.52%，采用经优化的超声辅助碱酶法其提取率要高于前者，差异有统计学意义(P<0.05).

2.2 超声辅助提取对TRP功能特性的影响

植物蛋白的溶解性是影响其在食品加工中应用的重要性质.由超声辅助提取对铁观音茶渣蛋白功能特性的影响(表4)可知，超声辅助提取的TRP溶解性高达81.12%，高于未处理样品，差异有统计学意义(P<0.05)，且高于王洪新等[12]及Ren等[14]的报道，可与大豆分离蛋白相媲美，良好的溶解性赋予TRP在食品领域中应用基础.同时发现，除乳化稳定性外，超声辅助提取TRP溶解性、乳化性、起泡性及泡沫稳定性均得到改善，差异有统计学意义(P<0.05)，较未处理TRP分别提高了41.44%，49.01%，60.91%.这可能是因为超声引起的蛋白质结构和表面基团发生了变化，此外，溶解性的提高也有利于蛋白界面性质的改善[22].

表4 超声辅助提取对铁观音茶渣蛋白(TRP)功能特性的影响Tab.4 Effect of ultrasonic-assisted extraction on functional properties of Tie Guanyin residue protein(TRP)

2.3 超声辅助提取对TRP抗氧化性的影响

超声辅助提取对TRP抗氧化性的影响如图2所示，在受试浓度范围内，TRP的DPPH·清除率和ABTS+·清除率均随浓度的增加逐渐增大，呈浓度依赖性.相同受试浓度下，和未经超声处理直接碱酶法提取的TRP相比，超声辅助提取蛋白样品的DPPH·清除率和ABTS+·清除率几乎均大于未处理样品，差异有统计学意义(P<0.05).未处理和经超声处理TRP的DPPH·清除率IC50值分别为29.61 μg/mL和25.84 μg/mL，ABTS+·清除率IC50值分别为223.63 μg/mL和140.65 μg/mL.因此，超声辅助提取使得TRP的DPPH·和ABTS+·清除率IC50值分别减小了12.73%和37.11%.这可能是由于超声空化效应使蛋白结构展开，更多活性基团暴露导致的[23].

图2 超声辅助提取对铁观音茶渣蛋白(TRP)DPPH·清除率和ABTS+·清除率的影响Fig.2 Effect of ultrasonic-assisted extraction on the DPPH·scavenging activity and ABTS+·scavenging activity of Tieguanyin residue protein (TRP)

3 结论

采用响应面试验对铁观音TRP超声辅助提取工进行优化，得到最佳条件为超声功率300 W，温度52 ℃，时间60 min.该条件下碱酶法制备TRP提取率为73.22%，高于直接采用碱酶法提取，二者差异有统计学意义(P<0.05)，表明该超声辅助碱酶法提取铁观音TRP的工艺可行.其功能特性及抗氧化性表明，超声辅助提取可以很好改善铁观音TRP的功能特性，特别是其溶解性、乳化活性及起泡性与泡沫稳定性分别提高了41.44%，49.01%，60.91%；同时超声辅助提取对TRP的DPPH·和ABTS+·清除率也有明显的改善作用，其IC50值分别降低了12.73%和37.11%.因此，经超声辅助碱酶法提取可以有效提高铁观音TRP的在食品领域中的应用价值，使铁观音茶渣中蛋白资源具有了一定的开发潜力.