HPLC法测定丙氨酰谷氨酰胺注射液含量分析方法的验证

张杰

（蚌埠丰原医药科技发展有限公司，安徽蚌埠233000）

丙氨酰谷氨酰胺是L-谷氨酰胺与L-丙氨酸缩合而成的二肽，丙氨酰谷氨酰胺注射液是肠外营养剂，主要用于需要进行肠外营养支持的患者，它的主要成分是丙氨酰谷氨酰胺，可以在体内分解为谷氨酰胺和丙氨酸。双肽分解释放出来的氨基酸可以作为营养物质储存在身体的相应部位，并且随着人体的需要进行代谢。对于许多病症来说，应用肠外营养支持时，病人可能容易出现谷氨酰胺的耗竭。因此，这个药物就可以为患者补充谷氨酰胺，防止患者谷氨酰胺的缺乏。

本文参考2020版《中国药典》（二部）中丙氨酰谷氨酰胺注射液分析方法，并对此方法进行了系统的方法学验证，符合2020版《中国药典》的要求。此方法操作简单方便，利用对照品外标法对主成分含量进行定量检测，准确度高，专属性强。

1 验证内容

笔者对此法开展了系统的方法学验证，包括系统适用性、线性和范围、准确度、精密度、溶液稳定性和耐用性，验证结果见表1。

表1 含量测定方法验证结果

1.1 仪器与试剂

Agilent1260高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；沃特世2489高效液相色谱仪，沃特世公司；Delta320酸度计，梅特勒-托利多公司。

丙氨酰谷氨酰胺注射液，批号为2117050501，安徽丰原药业股份有限公司；丙氨酰谷氨酰胺对照品，纯度99.1%，批号1071383，BACHEM；D-丙氨酰-L-谷氨酰胺（杂质Ⅴ），纯度98.9%，批号1062310，BACHEM；乙腈，色谱纯，DIKMA；磷酸二氢钾和磷酸，分析纯，国药集团；水，纯净水，屈臣氏。

1.2 测定方法

色谱条件与系统适用性试验：用氨基键合硅胶为填充剂；以0.05 mol/L的磷酸二氢钾缓冲液（用磷酸调节pH值至4.0）-乙腈（35∶65）为流动相；检测波长为215 nm，流速为0.7 mL/min；柱温为30℃。取D-丙氨酰-L-谷氨酰胺和丙氨酰谷氨酰胺对照品适量，加流动相溶解并稀释制成每1 mL中含D-丙氨酰-L-谷氨酰胺10μg和丙氨酰谷氨酰胺50μg的混合溶液，取20μL注入液相色谱仪，记录色谱图。理论板数按丙氨酰谷氨酰胺峰计算不低于3 000，D-丙氨酰-L-谷氨酰胺峰与丙氨酰谷氨酰胺峰的分离度应符合要求。

测定法：精密量取本品适量，用流动相稀释制成每1 mL中含丙氨酰谷氨酰胺约0.05 mg的溶液，作为供试品溶液，精密量取20μL注入液相色谱仪，记录色谱图；另取丙氨酰谷氨酰胺对照品适量，同法测定，按外标法以峰面积计算。

2 分析与讨论

2.1 系统适用性

系统适用性溶液：取D-丙氨酰-L-谷氨酰胺（杂质Ⅴ）和丙氨酰谷氨酰胺对照品适量，加流动相溶解并稀释制成每1 mL中含D-丙氨酰-L-谷氨酰胺10μg和丙氨酰谷氨酰胺50μg的混合溶液，作为系统适用性溶液。

取系统适用性溶液20μL连续注入液相色谱仪，计算峰面积和保留时间的相对标准偏差，结果见表2。

表2 含量系统适用性试验结果

2.2 线性与范围

取丙氨酰谷氨酰胺对照品100 mg，精密称定，置于100 mL量瓶中，加流动相溶解，并定容至刻度，摇匀，作为贮备液；精密量取贮备液2.5 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL、7.5 mL，分别置于100 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为线性溶液①②③④⑤。精密量取上述线性溶液各20μL注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，进行线性回归，线性图见图1，结果见表3。

图1 丙氨酰谷氨酰胺线性图

表3 含量线性与范围试验结果

2.3 准确度

对照品溶液：精密量取线性与范围中配制的贮备液5.0 mL，置于100 mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。

供试品溶液：精密量取贮备液5.0 mL置于100 mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为中浓度溶液（100%），配制三份。同法配制80%低浓度溶液、120%高浓度溶液各三份。

分别取上述溶液20μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法计算含量。测定结果见表4。

表4 含量准确度试验结果

2.4 精密度

2.4.1 重复性

对照品溶液：取丙氨酰谷氨酰胺对照品适量，精密称定，用流动相溶解并稀释制成每1 mL含丙氨酰谷氨酰胺0.05 mg的溶液，摇匀。

供试品溶液：精密量取供试品适量，用流动相稀释制成每1 mL含丙氨酰谷氨酰胺0.05 mg的溶液，摇匀。同法制备6份，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法计算含量。测定结果见表5。

表5 含量测定重复性结果

2.4.2 中间精密度

由另一分析人员在不同的仪器上进行测试。对照品溶液和供试品溶液的配制同重复性中对照品溶液和供试品溶液的配制。测定结果见表6。

2.5 溶液稳定性

供试品溶液：精密量取供试品适量，用流动相稀释制成每1 mL含丙氨酰谷氨酰胺0.05 mg的溶液，摇匀。将此供试品溶液在室温下放置24 h，并分别于0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、18 h和24 h取样测定，考查室温放置24 h内供试品溶液的稳定性，计算主峰保留时间和峰面积的RSD，结果见表7。

表6 含量测定中间精密度结果

表7 供试品溶液稳定性试验结果

2.6 耐用性

改变不同的色谱分析参数，考查色谱条件的耐用性。

对照品溶液：取丙氨酰谷氨酰胺对照品适量，精密称定，用流动相溶解并稀释制成每1 mL含丙氨酰谷氨酰胺0.05 mg的溶液，摇匀。

供试品溶液：精密量取供试品适量，用流动相稀释制成每1 mL含丙氨酰谷氨酰胺0.05 mg的溶液，摇匀。

2.6.1 不同色谱柱

精密量取上述溶液各20μL，分别考查不同色谱柱条件下测得的含量数据。不同色谱柱测定的结果见表8。

表8 不同色谱柱试验结果

2.6.2 不同检测波长

精密量取上述溶液各20μL，分别考查不同色谱柱、不同柱温条件下测得的含量数据。检测波长变化±5 nm，结果见表9。

表9 波长变化试验结果

2.6.3 不同柱温

精密量取上述溶液各20μL，分别考查不同柱温条件下测得的含量数据。柱温变化±5℃，结果见表10。

2.6.4 不同流速

精密量取上述溶液各20μL，分别考查不同流速条件下测得的含量数据。流速变化±0.1 mL/min，结果见表11。

表10 柱温变化试验结果

表11 流速变化试验结果

综上所述，采用不同色谱柱，改变检测波长、柱温和流速等条件，含量的RSD（n=6）值均小于2.0%，表明本方法的耐用性良好。

3 结束语

本文经试验说明方法的合理性，结合现行版《中国药典》中药品质量标准分析方法验证指导原则的要求，对此方法进行了全面的方法学验证，且符合分析方法验证指导原则要求，能够准确检出丙氨酰谷氨酰胺注射液的含量。