STING-Caspase-1信号通路对创伤性颅脑损伤大鼠认知功能障碍的作用

齐曼曼?王旭鹏?李妍?孙文波

【摘要】目的 探讨干扰素基因刺激蛋白（STING）-半胱天冬酶（Caspase-1）信号通路在颅脑创伤致大鼠认知功能障碍中的作用。方法 将48只清洁级雄性SD大鼠随机分为4组，假手术组（S组）、模型组（M组）、STING抑制剂C-176组（C组）和STING激动剂ADU-s100组（A组）各12只。通过重物自由落体撞击硬脑膜法建立创伤性颅脑损伤（TBI）模型。M组、C组和A组大鼠建立TBI模型后，C组和A组分别经腹腔注射C-176 10 mg/kg和ADU-s100 10 mg/kg。S组只行骨瓣开窗术。建模后第7日行Morris水迷宫测试评估大鼠认知功能，然后处死大鼠取其海马组织，采用免疫荧光法测定STING/胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、活化Caspase-1/Neuron表达情况。结果 与S组比较，M组、C组和A组大鼠Morris水迷宫测试的潜伏期延长，穿越平台次数减少，目标象限停留时间缩短，STING/GFAP、活化Caspase-1/Neuron阳性率上调（P均< 0.05）。与C组比较，M组、A组大鼠潜伏期延长，穿越平台次数减少，目标象限停留时间缩短，STING/GFAP、活化Caspase-1/Neuron阳性率上调（P均< 0.05）。与A组比较，M组大鼠潜伏期缩短，穿越平台次数增加，目标象限停留时间延长，STING/GFAP、活化Caspase-1/Neuron阳性率G下调（P均< 0.05）。结论 STING-Caspase-1信号通路可能参与了TBI中认知功能障碍的病理生理过程。

【关键词】干扰素基因刺激蛋白;創伤性颅脑损伤;认知功能;细胞焦亡;大鼠;

Morris水迷宫测试

Effect of STING-Caspase-1 signaling pathway on cognitive impairment induced by traumatic brain injury in rat models Qi Manman， Wang Xupeng， Li Yan， Sun Wenbo. Department of Anesthesiology， Cangzhou Central Hospital， Cangzhou 061000， China

Corresponding author， Sun Wenbo， E-mail： 15103172838@ 139. com

【Abstract】Objective To explore the role of stimulator of interferon genes （STING）-Caspase-1 signaling pathway on cognitive impairment induced by traumatic brain injury （TBI） in rat models. Methods Forty-eight clean grade healthy male SD rats were randomly and evenly divided into the sham-operation group （S group）， model group （M group）， C-176 group （C group） and ADU-s100 group （A group）. TBI rat models were established by using a weight-drop head injury method. After the establishment of TBI rat models， C-176 （10 mg/kg） and ADU-s100 （10 mg/kg） were injected intraperitoneally in the C and A groups. Bone flap fenestration alone was performed in the S group. At 7 d after the model was established， Morris water maze was performed to assess the cognitive ability of rats. Then， the rats were sacrificed and the hippocampus was taken. Immunofluorescent staining was used to determine the expression levels of STING/glial fibrillary acidic protein （GFAP） and cleaved-Caspase-1/Neuron. Results Compared with the S group， the latency was significantly prolonged， the number of passing the platform was remarkably reduced， the time of stay in the target quadrant was considerably shortened， and the positive rates of STING/GFAP and cleaved-Caspase-1/Neuron were significantly up-regulated in the M， C and A groups （all P < 0.05）. Compared with the C group， the latency was significantly prolonged， the number of passing the platform was remarkably reduced， the time of stay in the target quadrant was considerably shortened， and the positive rates of STING/GFAP and cleaved-Caspase-1/Neuron were significantly up-regulated in the M and A groups （all P < 0.05）. Compared with the A group， the latency was significantly shortened， the number of passing the platform was remarkably increased， the time of stay in the target quadrant was considerably prolonged， and the positive rates of STING/GFAP and cleaved-Caspase-1/Neuron were significantly down-regulated in the M group （all P < 0.05）. Conclusion STING-Caspase-1 signaling pathway is probably involved with the pathophysiological process of cognitive impairment induced by TBI in rat models.

【Key words】Stimulator of interferon genes;Traumatic brain injury;Cognitive function;Pyroptosis;

Rat;Morris water maze

创伤性颅脑损伤（TBI）是一种常见的、预后不良的意外伤害，近几年发生率不断攀高[1-2]。认知功能障碍是TBI后常见并发症，严重影响患者生活质量[3-4]。TBI的病理生理过程非常复杂，半胱天冬酶-1（Caspase-1）介导的炎性反应是细胞焦亡的经典途径，也是TBI发生发展的重要机制之一[5-6]。

Abdullah等[7]的研究表明，干扰素基因刺激蛋白（STING）信号通路的激活参与了TBI模型的脑损伤过程，并引起神经细胞焦亡。STING信号通路作为胞内感受器，其下游产物参与了多种炎症反应。但STING信号通路是否通过介导细胞焦亡进而调控TBI后海马组织的炎性反应尚未清楚。本课题组拟探讨STING-Caspase-1信号通路对TBI大鼠认知功能的作用。

材料与方法

一、动物选择及分组

清洁级健康雄性SD大鼠48只，9 ～ 10周龄，350 ～ 400 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供[许可证号：SYXK（京）2012-0036]。采用随机数字表法将大鼠分为假手术组（S组）、模型组（M组）、STING抑制剂C-176组（C组）和STING激动剂ADU-s100组（A组）各12只。对M组、C组和A组大鼠建立TBI模型。参考文献[8-9]，C组和A组建模后分别于腹腔注射C-176 10 mg/kg（上海皓元生物医药科技有限公司）和ADU-s100 10 mg/kg（上海皓元生物医药科技有限公司）。S组只行骨瓣开窗术。本研究符合动物实验伦理规范，通过沧州市中心医院伦理委员会审批[2020-006-01（Z）]。

二、TBI模型建立

于6% ～ 8%浓度的七氟烷下对大鼠进行麻醉诱导，采用面罩下自主呼吸吸入七氟烷（3% ～ 4%）和空气（1 L/min）的方式进行麻醉维持。将大鼠俯卧固定于铺有温毯的操作台上，设定温毯加热温度为38℃，对其进行体温监测及心电监测（上海玉研科学仪器有限公司，型号：XMTF-7000）。对大鼠作以下处理，头部皮肤消毒，铺巾，取正中切口并暴露顶骨，在前囟点后3.0 mm，中线右侧1.5 mm处开直径为6 mm的骨窗并保持硬膜完整。随后固定于立体定位仪（上海玉研科学仪器有限公司）上，将垫片（r = 2.5 mm）置于硬膜上，取20 g砝码于25 cm高度自由落体式撞击垫片上方撞杆，撞击处肿胀而硬膜不破裂为TBI模型成功。用骨蜡封闭骨瓣，双极电刀（武汉春光医疗美容仪器有限公司，型号：CHR-V）止血，缝合皮肤。

三、检测指标

1.采用Morris水迷宫测试评估空间记忆能力

进行Morris水迷宫测试前6 d为训练期。把实验平台置于水下1 cm，将大鼠面朝池壁随机放于水中任一象限内，当大鼠找到平台后，允许其在平台上休息30 s，并记录大鼠搜索平台所用时间，即潜伏期。如果在90 s内找不到平台，将其放置在平台上休息30 s，记录搜索平台的时间为90 s。确保所有象限在1 d内使用1次。第7 日为记忆期。第8日進行测试，移除平台，将大鼠面朝池壁随机放于水中任一象限。采用动物行为视频分析系统（上海吉量软件科技有限公司）跟踪记录大鼠的潜伏期、运动轨迹和穿越平台次数，并分析其空间记忆能力。

2.采用免疫荧光法测定STING/胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、活化Caspase-1/Neuron表达

结束Morris水迷宫测试后于七氟烷深麻醉下处死大鼠，经主动脉灌注40 g/L多聚甲醛后，取其脑组织并在10% 多聚甲醛中固定48 h，随后进行石蜡切片。将切片放入10 mmol/L柠檬酸钠抗原修复液中煮沸10 min，于常温下用0.3% Trion孵育20 min，加入免疫封闭液于37℃温箱内孵育1 h，

分别滴加兔多克隆抗体STING（稀释度1∶500，Abcam公司）和小鼠单克隆抗体GFAP（稀释度1∶500，上海碧云天生物技术有限公司），兔单克隆抗体活化Caspase-1（稀释度1∶500，Abcam公司）和小鼠单克隆抗体Neuron（稀释度1∶500，Abcam公司）一抗，于4 ℃孵育箱中过夜，然后分别加入Cy3标记山羊抗兔IgG（稀释度1∶200，上海碧云天生物技术有限公司）和FITC标记山羊抗小鼠（稀释度1∶200，上海碧云天生物技术有限公司）37℃孵育1 h。滴加DAPI（上海碧云天生物技术有限公司）后封片，于荧光显微镜（广州明美电子有限公司）下观察并计数，计算STING-Cy3/GFAP-FITC/DAPI、活化Caspase-1-Cy3/Neuron-FITC/DAPI三阳性细胞数占总细胞的百分比，计数5个高倍视野取平均值。

四、统计学处理

采用SPSS 21.0处理数据，正态分布的计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

结果

一、Morris水迷宫测试结果

Morris水迷宫测试结果显示，与S组比较，M组、C组和A组大鼠潜伏期延长，穿越平台次数减少，目标象限停留时间缩短;与C组比较，M组、A组大鼠潜伏期延长，穿越平台次数减少，目标象限停留时间缩短;与A组比较，M组大鼠潜伏期缩短，穿越平台次数增多，目标象限停留时间延长（P均< 0.05）;4组大鼠游泳速度差异无统计学意义（P > 0.05），见表1、图1。

二、海马组织STING和活化Caspase-1表达的比较

与S组比较，M组、C组和A组大鼠的海马组织STING/GFAP、活化Caspase-1/Neuron阳性率上调;与C组比较，M组、A组大鼠的海马组织STING/GFAP、活化Caspase-1/Neuron阳性率上调;与A组比较，M组大鼠的海马组织STING/GFAP、活化Caspase-1/Neuron阳性率下调（P均< 0.05），见表2与图2、3。

讨论

严重的创伤应激以及神经细胞的损伤可致TBI患者出现严重的认知功能障碍和明显的精神问题[10]。本研究组通过重物自由落体撞击硬脑膜法制备TBI模型，此法由于去除了颅骨，可避免因颅骨的差异性导致的损伤差异，当重物砸下时，完整的硬脑膜分散了冲击力，形成弥漫性脑损伤而不至于使损伤太过严重，提高了大鼠的生存率[11]。Morris水迷宫测试作为神经行为学经典实验，可反映大鼠的空间学习和记忆能力[12]。本研究结果表明，TBI大鼠海马组织代谢紊乱，空间记忆能力下降，提示海马组织受损并伴有认知功能障碍进而说明TBI模型制备成功。

星形胶质细胞是哺乳动物大脑内分布最广泛的一类细胞，也是胶质细胞中体积最大的一种[13]。以往的观点是星形胶质细胞只是起到支持作用，而不直接参与行为调节和学习记忆过程。近年来，科学家们开始仔细研究星形胶质细胞的各种潜在作用，发现其可调节葡萄糖代谢，维持线粒体稳定，促进学习记忆[14]。亦有研究表明，星形胶质细胞可以通过STING通路参与神经元的炎性反应进而介导各种精神疾病的病理生理过程[15]。GFAP是星形胶质细胞活化的标志物，GFAP升高是中枢神经系统对损伤作出反应的标志性信号[16]。

环状鸟苷酸腺苷合酶（cGAS）-STING信号通路即是胞质DNA（细胞死亡后，核中DNA进入胞质中）与cGAS结合后传递至第二信使环化二核苷酸（cGAMP），二聚体的STNG与cGAMP结合后发生构象改变，再通过一系列反应，募集TANK结合激酶1蛋白，进而磷酸化并激活干扰素调节因子和核因子活化B细胞κ轻链增强子，后者诱导了I型干扰素并激活了Caspase-1介导的细胞焦亡[17-18]。Caspase-1具促炎性，其催化活性受到炎性体依赖于信号的自身激活作用的严格调控[19]。依赖于炎性体的Caspase-1活化所致的具有高度炎性特征的细胞死亡即为细胞焦亡。细胞焦亡是一把双刃剑，其在消灭病原体的同时，过度免疫反应也会诱发多种自身免疫[20-21]。

本研究结果表明，TBI后大鼠出现认知障碍，同时伴有SING/GFAP、活化Caspase-1/GFAP表达上调;当加入STING激动剂后大鼠死亡率增加，认知功能障碍加重，SING/GFAP、活化Caspase-1/GFAP表达上调显著;当加入STING抑制剂后，大鼠认知功能改善，SING/GFAP、活化Caspase-1/GFAP表达下调，提示星形胶质细胞可能通过STING-Caspase-1通路参与了TBI模型中认知功能障碍的病理生理过程。

参 考 文 献

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（收稿日期：2020-11-29）

（本文編辑：洪悦民）