低温胁迫下北方强冬性区甘蓝型冬油菜的低温光合生理特征

邹娅，米文博，徐明霞，徐春梅，刘自刚，赵彩霞，米超

(1.甘肃农业大学农学院，干旱生境作物生物学国家重点实验室，甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室，甘肃 兰州 730070；2.西藏自治区农牧科学院农业研究所，西藏 拉萨 850002)

我国北方旱寒区光照充足，气温冷凉，非常有利于油菜籽生产.目前我国北方旱寒区冬油菜种植以白菜型品种为主，种植效益低是目前北方寒旱区冬油菜发展的主要问题.白菜型油菜植株生长势弱，籽粒产量低，品质差，茎秆软，易倒伏，不宜机械化收获；相对而言，甘蓝型冬油菜，茎秆坚硬，抗倒伏，适合机械化收获，且其生长势强，籽粒产量高，品质优.然而，甘蓝型冬油菜品种/系抗寒性较弱，不能抵抗北方强冬性区极端低温，因此，培育甘蓝型冬油菜抗寒品种/系是北方强冬性区能否种植甘蓝型冬油菜的关键.冬性作物越冬是贮存的有机物质的消耗过程，冬前光合产物积累对越冬有重大影响.我国北方旱寒区冬油菜一般8月中下旬至9月上中旬播种，幼苗生长至 4～5 叶期即经历明显的降温过程，随后进入冬前低温生长阶段.冬油菜能否高效利用冬前低温阶段的光热资源进行光合作用，积累充足的光合有机物，是越冬期根部抵御冬季严寒而安全越冬，以及翌年返青营养器官重建的关键.近年来，本课题组已育成多个强抗寒品种(系)，在甘肃会宁(冬季极端低温为-26 ℃)等强冬性区种植，越冬率可达90%以上，较好地解决了甘蓝型冬油菜越冬问题.因此，研究低温对甘蓝型冬油菜光合生理变化，对北方旱寒区甘蓝型冬油菜强抗寒品种应用有重要意义.

叶绿体是植物光合作用重要的细胞器，叶绿体结构的完整性会影响其光合功能.植物叶片受低温胁迫后光合机构受损，光能利用率、光化学转化效率下降，光合电子传递活性减弱.抗寒植物在一定低温下光合膜较稳定，相关保护性酶活性较高，光合能力较强，可为植物生长发育提供能量[1-3].研究表明，净光合速率直接体现了植物光合能力，也是光合系统正常的检验指标之一[4]，对于强抗寒品种，在低温胁迫下叶绿体外膜完整清晰，基质片层结构较完整，其内仍有少量淀粉粒存在，而抗寒性弱的品种相邻叶绿体融合，叶绿体外膜破裂，基质片层断裂[5].

常温条件下，植物细胞处于正常水分状态，活性氧产生后可被抗氧化酶系统迅速清除，从而整个代谢处于平衡状态[6].大量研究表明，植物抗寒性强弱与抗氧化酶活性密切相关[7-8].低温胁迫会引起植物膜脂过氧化，从而使植物受到冷伤害[9]，研究表明丙二醛的含量可以作为衡量逆境对生物膜危害程度的指标[10-11]，丙二醛含量与抗寒性密切相关.低温胁迫下，白菜型冬油菜抗氧化酶活性升高，渗透调节物质含量增加，并且抗寒性不同的材料生理特性变化不同[12].

利用冬前低温阶段有限光热资源进行光合产物积累，是作物抵御冬季严寒，安全越冬的关键.本研究以4份甘蓝型冬油菜为材料，研究低温胁迫对甘蓝型冬油菜幼苗叶片生理特性、形态结构、叶绿体超微结构、光合特性的影响，为甘蓝型冬油菜抗寒种质挖掘、抗寒性评价及品种筛选提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 试验设计

以TSG10、天油2266、天油2288、Vision 4个甘蓝型油菜为材料(均由甘肃农业大学提供)，选取籽粒饱满、大小均一、无病虫害的甘蓝型冬油菜种子，用70%酒精消毒1 min，10%氯化钠溶液消毒1 min，后用无菌水冲洗干净，播于装有育苗基质的盆钵中，每盆定苗4株.幼苗五叶期放入低温光照培养箱进行低温处理.光照条件为光/暗(25 ℃/20 ℃)，常温处理作为对照，-4 ℃处理24 h作为低温处理组，分别观察各品种幼苗形态及叶绿体超微结构变化，测定生理指标、光合气体交换等指标.试验设置3个生物学重复.

1.2 试验方法

1.2.1 甘蓝型冬油菜形态特征观察 观察并拍照记录低温胁迫前后甘蓝型冬油菜幼苗叶片形态变化及受冻情况.

1.2.2 甘蓝型冬油菜生理指标的测定 常温作为对照组(CK)，-4℃处理24 h作为低温处理组.参照邹琦[13]的方法，测定不同品系甘蓝型冬油菜叶片超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase,SOD)、过氧化物酶 (peroxidase,POD)、过氧化氢酶 (catalase,CAT)、APX、可溶性蛋白(soluble protein,SP)、可溶性糖(soluble sugar,SS)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、脯氨酸(proline,Pro)[14]、电导率等生理指标.

1.2.3 甘蓝型冬油菜叶绿体超微结构的观察 叶绿体超微结构观察方法参照 Lichtenthaler等[15]和赵云等[16]的方法.分别取对照组和低温处理组幼苗的第4片叶片观察细胞超微结构.将叶片切成(2 mm×4 mm)碎片浸入2.5%戊二醛中，4 ℃下固定24 h.然后用0.1 mol/L磷酸缓冲液冲洗3次，置于4 ℃下1% 锇酸中固定5 h，并置于0.1 mol/L磷酸钠中漂洗25 min；将固定好的组织样品依次放入50%、70%、80%、90%、100%丙酮中脱水；嵌入到Spurr培养基中，然后用Epon 812进行聚合后树脂包埋.用含有醋酸铀酰和雷诺柠檬酸铅双重染色8 min，TEM-1200EX透射电镜观察叶绿体超微结构.

1.2.4 光合气体交换参数测定 低温处理前后，采用 LI-6400 便携式光合仪测定每个处理幼苗的第3片叶的叶片净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)、蒸腾速率(Tr)等，叶室(2 cm×3 cm)内设定温度 20 ℃，测定时间为上午 8∶30～10∶00，光强为 600 μmol/(m2·s)；每个处理测定3株，每株测3次.

1.3 统计分析

2 结果与分析

2.1 低温对甘蓝型冬油菜幼苗形态特征的影响

常温下，甘蓝型冬油菜叶片平展，直立生长；低温处理(-4 ℃)24 h后，强抗寒品种TSG10植株呈半匍匐状态，叶色变化较小，仍保持了深绿色；抗寒性较弱的品种天油2288、天油2266叶片边缘卷曲，3个抗寒性较弱的品种部分叶面颜色呈现暗红色，叶片出现一定程度的失绿现象，表明低温下甘蓝型冬油菜强抗寒品种能更好维持光合色素的稳定性(图1).

2.2 低温对甘蓝型冬油菜抗氧化酶活性的影响

研究结果表明，低温处理后不同品种甘蓝型冬油菜幼苗抗氧化酶活性均有不同程度的升高(图2)，有效清除低温逆境下体内积累的活性氧自由基，增强幼苗对低温的抵抗能力.低温处理后，TSG10、天油2266、天油2288和Vision SOD活性分别较对照增加了13.5%、52.7%、107.9%和109.5%；POD活性分别较对照增加了26.9%、70.0%、31.5%和31.0%；CAT活性分别较对照增加了14.4%、29.3%、22.1%和35.6%；APX活性分别较对照增加了59.7%、62.7%、59.7%和77.5%.方差分析表明：低温处理后，TSG10和天油2266 POD活性差异显著，而天油2288和Vision差异不显著，4个品种的CAT活性差异均不显著.综上，低温胁迫后甘蓝型冬油菜叶片抗氧化酶活性均呈现上升趋势，各品种间达到显著差异(P<0.05)水平，品种间抗氧化酶活性上升幅度大致为：TSG10>天油2266>天油2288>Vision.

图1 低温胁迫下不同品种甘蓝型冬油菜幼苗形态变化Figure 1 Morphological changes of different winter Brassica napus varieties seedlings under low temperature stress

图中不同英文字母表示在不同处理间差异显著(P<0.05).Different letters above histogram graphs indicate significant difference among each treatment (P<0.05).图2 低温胁迫下不同甘蓝型冬油菜品种抗氧化酶活性变化Figure 2 Effect of low temperature on antioxidant enzyme activities of different winter rapeseeds

2.3 低温处理对甘蓝型油菜渗透调节物质含量的影响

SS、SP和Pro作为植物体内重要的渗透调节物质，经过低温胁迫后含量上升，植株通过增加它们的含量来调节机体的渗透调节机制，降低机体内自由水的含量，增加机体对寒冷的抵抗能力.低温胁迫后甘蓝型冬油菜SS、SP、Pro含量均较对照呈显著上升趋势(图3).方差分析表明：低温处理后，4个品种的可溶性糖含量差异显著；TSG10与其他3个品种SP的差异显著；Pro含量较对照大幅度上升，品种间差异显著.低温胁迫后，TSG10、天油2266、天油2288和Vision可溶性糖含量分别较对照增加了200.5%、173.2%、128.2%和118.6%；SP含量分别增加了85.0%、107.4%、98.3%和81.6%；Pro含量分别增加了279.2%、280.5%、305.5%和289.5%.综上，各品种渗透调节物质活性表现为TSG10>天油2266>天油2288>Vision.

图中不同英文字母表示在不同处理间差异显著(P<0.05).Different letters above histogram graphs indicate significant difference among each treatment (P<0.05).图3 低温胁迫前后不同甘蓝型冬油菜品种渗透调节物质含量的变化Figure 3 Osmotic adjustment substances changes in different winter rapeseed varieties under low temperature stress

2.4 低温处理对甘蓝型油菜膜氧化损伤的影响

常温下，不同甘蓝型冬油菜品种间电导率变化幅度较小(图4).低温处理后，4个品种的电导率均显著上升.其中上升幅度最大的为Vision，较对照增加了82.6%，其次是天油2288(64.2%)和天油2266(55.9%)，上升幅度最小的是TSG10(44.2%).表明，低温胁迫下，强抗寒品种TSG10电解质渗出较少，质膜完整性及通透性较好，质膜稳定性明显优于冷敏感品种Vision.

丙二醛作为膜脂氧化的主要产物，其含量可以直接反应植物受逆境胁迫的程度.常温下，甘蓝型冬油菜不同品系 MDA 含量差异不明显(图4).低温胁迫下，不同品种丙二醛含量均有所增加，但TSG10、天油2266和天油2288丙二醛含量较常温增加不显著，Vision含量增加显著.表明在低温胁迫过程中，抗寒性品种膜脂过氧化程度较小，丙二醛含量较低，叶片受冻害程度小.

2.5 低温胁迫对甘蓝型冬油菜叶绿体超微结构的影响

常温下，叶绿体紧密分布在细胞壁内侧，液泡膜和质膜完整，叶绿体形状规则呈椭圆形，内含2～3个淀粉粒，基质片层排列有序(图5).低温处理后，液泡膜和质膜出现破裂现象，部分细胞质基质渗出，叶绿体内淀粉颗粒增多，且体积变大，部分叶绿体膜出现破裂，基质片层也出现断裂现象.低温处理后，TSG10大部分叶绿体仍整齐排布在细胞壁内侧，个别叶绿体膜出现破裂，表明其叶绿体膜质结构轻微受损；天油2266中大部分叶绿体仍整齐排布在细胞壁内侧，且叶绿体形状变为纺锤形，叶绿体基质片层出现断裂，细胞内膜质系统出现损伤，淀粉粒体积较对照增大；天油2288叶绿体基质片层断裂较严重，叶绿体内淀粉粒数目和体积均较对照显著增加，细胞内膜质系统损伤较重；Vision叶绿体膜质损伤，液体外渗，叶绿体基质片层紊乱，大部分断裂，淀粉粒显著积累(图5).低温胁迫造成甘蓝型冬油菜叶绿体光合膜结构损伤，相较于弱抗寒品种，强抗寒品种受低温胁迫时叶绿体结构损伤较小.综上，叶绿体中淀粉粒的积累速率可直接反应品种的抗寒性，抗寒性强弱表现与生理特性相吻合.

图中不同英文字母表示在不同处理间差异显著(P<0.05).Different letters above histogram graphs indicate significant difference among each treatment (P<0.05).图4 低温胁迫前后不同甘蓝型冬油菜品种电导率与丙二醛含量的影响Figure 4 The electrical conductivity and malondialdehyde content changes in different winter rapeseed varieties under low temperature stress

图5 低温下甘蓝型冬油菜叶绿体超微结构变化Figure 5 Changes of chloroplast ultrastructural in winter rapeseed under low temperature stress

2.6 低温胁迫对甘蓝型冬油菜光合参数的影响

低温胁迫下，不同甘蓝型冬油菜叶片Gs、Tr、Pn较对照明显降低，而Ci较对照呈上升趋势(图6)，不同甘蓝型冬油菜品系Pn存在显著差异(P<0.05).TSG10叶片Pn显著高于其他3个品种，低温胁迫后Pn降低幅度表现为：TSG10(69.49%)<天油2266(86.56%)

低温胁迫下，甘蓝型冬油菜叶片Ci较对照明显升高.Ci上升幅度表现为TSG10(32.92%)>天油2266(41.03%)>Vision(41.36%)>天油2288(43.92%)；Tr较对照明显降低，降幅度表现为TSG10(72.87%)

图中不同英文字母表示在不同处理间差异显著(P<0.05).Different letters above histogram graphs indicate significant difference among each treatment (P<0.05).图6 低温胁迫前后不同甘蓝型冬油菜品种光合气体交换参数变化Figure 6 Effects of low temperature on photosynthetic gas exchange parameters in different winter rapeseed varieties under low temperature stress

3 讨论

低温胁迫下植物体内抗氧化酶活性在一定程度上可以反应植物的抗寒性[17].低温胁迫下，膜系统受损与生物氧自由基有关，植物体内会积累大量的活性氧自由基，会对生物体产生过氧化损害[18]；同时，植物体内也会合成一些物质，维持植物体内活性氧等自由基的生成与清除平衡.SOD、POD、CAT是细胞膜保护酶，在维持这种动态平衡过程中起着至关重要的作用.酶活性越高，消除氧自由基的能力愈强，植物的抗逆性也较强[19].本研究中，甘蓝型冬油菜幼苗感受低温胁迫时，强抗寒品种体内的SOD、POD、CAT活性较高.这一结论也在白菜型冬油菜[2,22]和扁桃[21]的研究中得到应证.MDA作为膜脂氧化的主要产物，其积累的多少可以反映植物受逆境胁迫程度[23].本研究显示，低温胁迫下，弱抗寒品种MDA含量升高显著，说明弱抗寒品种受低温损伤更严重.因此MDA含量可作为评判冬油菜抗寒性强弱的指标之一.低温胁迫下，植物体内SS、SP和Pro含量增加与植物抗寒性密切相关[24].本研究中，SS、SP和Pro含量均增加.SP可以积累于细胞中，引起渗透压加大，有助于植物对低温胁迫的适应性[25].低温胁迫下SS积累，提高了细胞渗透势，有利于细胞渗透调节，保护膜结构[26].本文结果也在章锦涛等[27]和孔祥会等[28]的研究中得到印证.也有研究指出，脯氨酸含量不仅与抗寒性有关，也随植株的生长发育发生变化.抗艳红等[29]对马铃薯的研究中得出，当进入花期后脯氨酸含量明显上升.这一结论是否适用于油菜还需进一步论证.低温胁迫下，植物体内膜系统发生破裂，膜内物质就会渗出到周围环境，从而导致细胞的电导率增大.电导率大小也反映植物受逆境损害程度.罗宁等[30]对低温胁迫下玉米根系电导率的研究得出，低温胁迫下，强抗寒品种能够保持较高的质膜流动性及通透性.本研究中，抗寒性不同的甘蓝型冬油菜在低温胁迫下电导率呈显著上升趋势，弱抗寒性的甘蓝型冬油菜品种上升幅度高于强抗寒性品种.包玲玲[31]对水稻的抗寒性研究中得出，电导率在低温胁迫下越高，表示水稻叶片受到的低温伤害越大，细胞膜受破坏程度和细胞受氧化损伤程度越高.

光合作用是植物物质积累与生理代谢过程，本研究结果表明，低温胁迫下甘蓝型冬油菜叶片净光合速率显著降低，较于强抗寒品系，弱抗寒品系净光合速率下降幅度更大，机体积累的有机物少；同时显微镜观察发现叶绿体结构发生改变，基粒溶解、基质片层断裂，膜有序结构被破坏；膜及结合分子的有序性、膜囊内外电荷规则分布和膜电势形成，影响光能捕获和转换、电子传递和光合磷酸化等，进而影响光合作用的高效进行[32-33]；基粒垛堞结构和基质片层损失导致膜结合分子排列有序性的丧失和跨膜电势建立困难，最终导致叶片Pn的降低.北方强冬性区冬油菜入冬后地上部分全部枯萎，越冬期根部抵御冬季寒冷，以及翌年返青进行地上部营养体重建，都需要根部冬前积累足够的贮藏物.在冬油菜种植中也发现，越冬前地下根部直径> 1 cm，地上着生8～10叶的植株，有更大几率通过北方寒冷的冬季而安全越冬；相反，冬前植株和根直径较小的植株，通常难以安全越冬.

4 结论

低温胁迫后，甘蓝型冬油菜强抗寒品种较好维持了叶片光合色素稳定性，植株向半匍匐状态过渡；有较强抗氧化和渗透调节能力，较好维持了叶绿体膜完整性和基质片层的连续性，保持了较高的光合合成能力.依据低温形态、生理及光合特征等，甘蓝型冬油菜不同品种抗寒性表现为：TSG10>天油2266>天油2288>Vision.