联合使用多种数据库分析KIAA0101对三阴性乳腺癌的影响

谭雅文，刘繁，孙诗瑶，谢萍，刘国文

(1.深圳市第二人民医院(深圳大学第一附属医院)甲状腺乳腺外科， 广东深圳 518000；2.首都医科大学基础医学院细胞生物学系，北京 100069)

据世界卫生组织发布的《2020年全球最新癌症负担报告》，2020年全球乳腺癌新发病例226万例，已经超越肺癌成为全球发病第一的恶性肿瘤[1]。 同年，乳腺癌全球相关死亡病例约68万例，成为全球第五的癌症致死病因[1]。乳腺癌在分子水平上具有很强的异质性，临床上根据免疫组化标记的异同，将乳腺癌分为4种不同的亚型，三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer， TNBC)是其中一类特殊的分子分型，其缺乏雌激素受体、孕激素受体以及人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)的表达，大约占乳腺癌总数的16%[2]。由于TNBC缺乏以上受体的表达，其对现有的内分泌药物、靶向药物均无效，目前其主要治疗仍然依靠手术及化疗，加之其在已知的乳腺癌分型中侵袭性最强，早期复发率及远处转移率高，故TNBC的预后很差[3-4]。

Kazusa cDNA计划是一个旨在开展广泛的人类 cDNAs 测序的项目，来预测未知的人类基因的编码序列，科学家将此计划新发现的基因命名为“KIAA”基因，也被称作未知基因，到目前为止一共发现了两千多个KIAA基因[5]。近年来KIAA基因的研究主要着眼于识别其编码的蛋白质的生理功能。KIAA0101基因，又被叫做PCNA 相关因子(PCNA associated factor，p15 PAF)， 编码增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)蛋白[6]，该蛋白为DNA复制和DNA损伤修复过程中的必要蛋白。KIAA0101参与调控多种生物学过程，如DNA损伤修复[7]、细胞周期和细胞增殖[8]。它的异常表达已经被证实与多种肿瘤的发生、发展密切相关，也被认为是多种恶性肿瘤的癌基因，在多种恶性肿瘤的恶性进程、预后[6]以及耐药[9]中发挥着重要作用。有研究报道[10]，KIAA0101在乳腺癌中高表达，但是暂时没有KIAA0101与三阴性乳腺癌的相关报道。本课题联合使用多种数据库分析KIAA0101在TNBC中的表达及其对该类患者预后的影响，以期为进一步研究KIAA0101在TNBC中的作用机制提供线索和思路。

1 材料与方法

1.1 数据库资料下载

在GEO数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)中搜索人三阴性乳腺癌数据集，通过对表达谱芯片的信息进行分析，确定将来源于GSE38959和GSE27447中27例非肿瘤乳腺癌样本和35例三阴性乳腺癌样本数据纳入本研究。

1.2 筛选差异表达基因

利用GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/) 对来自GEO的数据进行整合， 并以|log FC|>1、P<0.05为标准进行差异表达基因筛选，然后使用在线分析网站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)进行韦恩分析，得到重叠的差异表达基因。

1.3 GEPIA数据库分析

利用GEPIA数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/)检索WIF1与RERGL在TNBC癌组织中的表达情况，检索条件为：① Cancer: Breast invasive carcinoma；② Gene：WIF1; RERGL；③ Matched Normal data：Match TCGA normal and GTEx data。在GEPIA数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/)中检索PMCHL1和KIAA0101在乳腺癌组织中的表达情况， 检索条件为：① Cancer：Breast invasive carcinoma； ② Gene：PMCHL1；KIAA0101； ③ Matched Normal data: Match TCGA normal and GTEx data。

1.4 UALCAN数据库分析

通过UALCAN数据库(http://ualcan.path.uab.edu)获取KIAA0101基因在乳腺癌内的表达情况，通过Expression选项中sample type、major subclasses、cancer stage和nodal metastasis status等分类预测KIAA0101在三阴性等乳腺癌中的表达情况。

1.5 免疫浸润

在TIMER数据库(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)中下载TCGA样本中免疫细胞浸润水平矩阵，将KIAA0101表达水平与检索结果进行相关性分析，得到其与免疫细胞浸润程度的相关性。

1.6 生存分析

使用Kaplan-Meier Plotter数据库在线分析，检索KIAA0101基因，得到三阴性乳腺癌患者差异表达KIAA0101的生存曲线。限定条件：总生存期(overall survival，OS)和无复发生存率(recurrence-free survival，RFS)，进行预后分析。

2 结 果

2.1 筛选差异表达基因

对GSE38959和GSE27447芯片进行韦恩分析得到25个重叠的差异表达基因，其中表达上调的基因有12个(图1A)，下调基因有13个(图1B)。GO功能富集分析表明这些重叠的差异基因在胞外区域、信号转导、负向调节Wnt信号通路、正向调节脂肪细胞分化、Wnt-蛋白质结合等方面起作用(图1C)。差异柱状图分别显示了两个数据集中重叠的差异基因表达情况，数据集GSE38959中KIAA0101上调最显著，数据集GSE27447中PMCHL1上调最显著(图1D)。

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2.2 在常见肿瘤组织中的PMCHL1和KIAA0101 mRNA水平

用GEPIA数据库对PMCHL1和KIAA0101在人体各器官肿瘤组织中的mRNA水平进行了分析，结果提示PMCHL1 mRNA在TNBC癌组织中表达升高不明显，P值不具有统计学意义(图2A)，而KIAA0101在TNBC癌组织中升高显著，较正常组织升高明显(P<0.05)(图2B)。

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2.3 KIAA0101 mRNA水平与TNBC进展相关

通过UALCAN数据库，基于sample type、major subclasses、cancer stage和nodal metastasis status等分类比对了KIAA0101 mRNA在癌组织中的表达情况，发现KIAA0101 mRNA在乳腺癌组织中的含量显著高于癌旁组织(P<0.001)(图3A)，并且在TNBC不同亚型和不同临床分期中KIAA0101 mRNA在癌组织中表达量也均高于癌旁组织(图3B和3C)。此外，分析数据显示与无淋巴结转移的患者(N0)相比，N1-N3期淋巴结转移患者的KIAA0101 mRNA出现升高(P<0.001)(图3D)。

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2.4 KIAA0101的表达量和免疫细胞浸润数量呈正相关

使用TIMER数据库对KIAA0101与免疫细胞浸润联系进行在线分析， 发现KIAA0101的表达情况与TNBC中B细胞(P<0.001)、中性粒细胞 (P=0.02) 浸润均呈正相关， 并且与B细胞的相关性最强。与CD8+T细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞、树突状细胞浸润不相关(图4)。

图4 KIAA0101 mRNA表达量对免疫细胞浸润的影响

2.5 KIAA0101的表达对TNBC患者预后的影响

通过对Kaplan-Meier Plotter数据库进行分析， 发现在TNBC中高表达KIAA0101患者的OS较低表达患者显著缩短， 差异具有统计学意义(HR=2.45,P=0.0073)。此外，在TNBC样本中，KIAA0101与患者RFS无明显联系，差异无统计学意义(HR=0.81,P=0.27)(图5)。

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3 讨 论

乳腺癌作为一种严重威胁人类健康的疾病，发病率、死亡率正在逐年增加。2020年，全球乳腺癌新发病例高达226万例，新增的乳腺癌相关死亡病例约68.5万例[1]。据不完全统计，每年中国乳腺癌新发病例和死亡人数分别约占全世界的12.2%和9.6%[11-12]。而TNBC与其他亚型乳腺癌相比，具有肿瘤组织学分级高，复发转移率高等特点，由于其侵袭性高，很多患者在初诊时临床分期相对较晚[13]。目前，TNBC的有效治疗手段非常有限，手术是其局部治疗的最佳方案，而化疗则是目前唯一有效的辅助治疗方法。虽然乳腺癌治疗手段层出不穷，但针对TNBC的治疗没有突破性进展，由于治疗手段的匮乏，TNBC的总体预后仍然没有得到改善。这就促使科研工作者不断寻找治疗TNBC的新方法，探寻与TNBC有关的差异基因表达，以寻找新的肿瘤治疗靶点。

KIAA0101含有一个保守的PCNA结合基，与CDK抑制剂p21竞争结合 PCNA[9]。有研究证明，KIAA0101可以与BRCA1结合，从而影响中心体的数量[10]。此外，KIAA0101的转录变体1可以抑制p53激活，从而阻止使用阿霉素诱导的细胞凋亡[14-15]。还有研究证明KIAA0101 的过表达，可以激活 PI3K/AKT/mTOR 通路，抑制肿瘤细胞凋亡、自噬，从而导致顺铂类药物的耐药[9]。KIAA0101在多种性肿瘤中表达升高， 如胃癌[16]、 乳腺癌[10]、 食管癌[17]、肝癌[18]，并可能与癌症患者的预后相关[6]。

本研究通过使用GEO、GEPIA、UALCAN、TIMER和 Kaplan-Meier Plotter 等数据库挖掘KIAA0101基因表达的相关数据，探寻其在三阴性乳腺癌中的表达、免疫细胞浸润及与预后的关系。

研究发现，癌变组织的SORT1水平显著高于非癌变组织，SORT1 mRNA水平在乳腺癌发生发展过程中会出现升高，并且发现在所有三阴性乳腺癌的亚型中均出现升高，尤其是TNBC-LAR亚型中升高最为显著。在人蛋白数据库(Human Protein Atlas， HPA)(https://www.proteinatlas.org)内检索关键字“KIAA0101”， 选择 “Pathology” 模块， 并未找到KIAA0101抗体在三阴性乳腺癌中蛋白免疫组化结果。但Kais[10]和Wang[19]等研究发现，KIAA0101在乳腺癌中高表达，那么在接下来的研究中，可利用临床病理样本，从蛋白表达水平上分析 KIAA0101与TNBC发生发展的关系。

其后，使用TIMER数据库对KIAA0101与免疫细胞浸润之间的关系进行在线分析，发现KIAA0101的表达与B细胞、中性粒细胞浸润呈正相关，表达量增加，在B细胞中尤为明显，这可能为寻找TNBC免疫治疗新靶点提供一个新思路。

最后通过Kaplan-Meier Plotter数据库进行预后分析，发现高表达KIAA0101会对患者总生存期产生不良影响，即从转录水平发现KIAA0101的表达会TNBC患者带来不良的预后，由此进一步证明KIAA0101基因可能有促进TNBC进展的作用。然而，这些实验结果均来自芯片检测结果，相关结论尚有待后续验证。

同时， 关于KIAA0101如何与其他分子发生相互作用来影响TNBC的发展需要进一步的研究； KIAA0101在TNBC中的转化应用也需要更多的实验数据来支撑。为了进一步明确KIAA0101与TNBC之间的关系，接下来将利用临床样本，从蛋白表达水平上分析其与TNBC的关系，并分析其与患者预后的关系。

综上，KIAA0101在三阴性乳腺癌组织中表达升高，且与其临床分期呈正相关；另外，它还影响患者的生存预后，与免疫细胞浸润密切相关，在一定程度上提示了KIAA0101作为三阴性乳腺癌潜在治疗靶点的可能，也为进一步研究KIAA0101基因与三阴性乳腺癌的关系奠定了基础，希望为三阴性乳腺癌的治疗提供一定的理论依据，并开拓新的治疗思路。