蝇蛆粉替代鱼粉对杂交黄颡鱼生长性能、体组成和抗氧化能力的影响

杨贺舒 孙俊霄 袁勇超 樊启学 李明波 莫爱杰

(1. 华中农业大学水产学院, 长江经济带大宗水生生物产业绿色发展教育部工程研究中心, 农业农村部淡水生物繁育重点实验室, 湖北省水生动物病害防控工程技术研究中心, 武汉 430070; 2. 潜江市水产技术推广中心, 潜江 433100)

随着集约化养殖程度的不断提高, 近年来鱼粉供应量的短缺和不稳定导致鱼粉价格不断飙升, 寻找优质蛋白源替代鱼粉(FM)成为水产动物营养研究的热点和难点[1—3]。目前, 许多研究学者开展了有关植物蛋白源替代鱼粉对水生动物生长性能影响的研究。如果水产饲料中植物蛋白添加量达到适宜比例, 水产养殖动物的生长性能及饲料利用效率达到最佳水平, 饲料性价比获得最好体现[4]。这也是研究者们最期望达到的研究目标, 但该适宜添加水平因实验动物种类、实验动物大小、饲料配方组成和具体养殖条件而存在较大差异[5]。当水产饲料中植物蛋白添加量超过适宜比例时, 随着饲料中植物蛋白源替代鱼粉蛋白比例的上升, 水产养殖动物的生长性能会表现出急剧下降[6,7]。与植物蛋白源相比, 动物蛋白源通常具有较好的适口性, 氨基酸组成也较为平衡[8,9]。其中, 昆虫蛋白被认为是动物蛋白源中一种较为优质的潜在蛋白来源[3,10,11]。昆虫蛋白原料蛋白质含量高, 富含必需氨基酸和不饱和脂肪酸[12], 但因其成分具有不确定性, 限制了昆虫蛋白在饲料中的广泛使用。家蝇的繁殖速度快, 生命周期较短, 繁殖率高, 是优质的昆虫资源之一[12]。蝇蛆粉的蛋白含量约为 50%, 粗脂肪含量为8%—20%, 富含矿物质和微量元素等营养成分[3,11,13,14]。同时, 蝇蛆蛋白中含有几丁质、抗菌肽和溶菌酶等免疫活性物质, 在饲料中使用可以提高水产动物的抗病能力[15]。刘黎等[16]研究发现, 在饲料中添加5%的蝇蛆蛋白青鱼的终末体重和特定生长率显著升高且可以提高青鱼的肝胰脏消化酶活力。刘远红等[17]发现, 蝇蛆粉替代鱼粉水平小于40%时, 对黄颡鱼的肌肉品质没有显著影响。而蝇蛆粉在不同的养殖鱼类中使用会对其幼鱼的生长性能产生不同的影响, 有些鱼类没有表现出显著性的差异, 而有些鱼类的生长性能表现出显著性下降,同时对鱼类抗氧化能力也存在一定的影响[3,11,13,14]。

黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco(Richardson)隶属鲇形目 (Siluriformes)、鲿科 (Bagridae)、黄颡鱼属 (Pelteobagrus), 俗名黄姑鱼、黄嘎、黄腊丁等,广泛分布于我国江河、湖泊、水库等自然水域的底栖、小型、经济鱼类[18]。受市场消费需求的影响, 黄颡鱼养殖面积增长较快, 养殖产量已从 2003年的 5.48×107kg增长至 2018 年的 51×107kg, 16 年时间增长了近 9 倍, 发展成为南至两广、北至辽宁、东起江浙、西至川陕及中部各大省份的全国性养殖鱼类[19]。杂交黄颡鱼“黄优 1 号”是采用群体选育, 以主要生长性能指标(体重)为选育目标进行逐代选育和筛选, 严格按照“黄优1号”繁育技术路线及工艺流程进行苗种繁育, 历时多年培育出的水产新品种, 与普通黄颡鱼相比, 杂交黄颡鱼“黄优1 号”具有生长快、摄食量大和更好的耐低氧等能力[20,21]。目前关于鱼粉替代对普通黄颡鱼的影响有少量报道[22—25], 但对杂交黄颡鱼的影响还未见报道。本实验的目的是评估蝇蛆粉替代鱼粉对杂交黄颡鱼生长性能、体组成和抗氧化能力的影响, 为蝇蛆蛋白在杂交黄颡鱼饲料中的应用提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 饲料配方与饲料制作

配置 6 组等蛋白的饲料(表 1), 在对照组(G0)中, 饲料粗蛋白含量为 42%, 鱼粉提供 50% 的蛋白含量, 使用蝇蛆粉分别替代鱼粉, 替代比例分别为 20%、40%、60%、80% 和 100% 的鱼粉蛋白。使用的鱼粉及蝇蛆粉的营养成分及氨基酸的组成见表 2。蝇蛆粉购自荣飞生态科技有限公司(安徽芜湖)。饲料原料经过 60 目筛, 在充分混匀后, 使用制粒机将其压制为 2 mm直径的饲料颗粒,50℃ 烘干水分, 使用自封袋封口, 并于 −20℃ 冰箱中保存。

表 1 饲料配方及营养成分(干物质基础)Tab. 1 Composition of diets (dry basis)

表 2 鱼粉与蝇蛆粉常规营养成分与氨基酸含量(g/100 g, 干重)Tab. 2 Proximate and amino acid compositions of reference and ingredients used in the test diets (g/100 g, dry basic)

1.2 养殖实验和样品采集

本实验使用的杂交黄颡鱼“黄优 1 号”(Pelteobagrus vachelli♂×Pelteobagrus fulvidraco♀)由湖北黄优源渔业发展有限公司鲁湖基地提供。挑选规格整齐, 健康无病的幼鱼 720 条, 初始体重为(0.62±0.01) g。

实验在华中农业大学水产学院科研基地的流水养殖系统中进行, 使用体积为 180 L 的玻璃养殖缸进行养殖。在实验开始前, 所有实验鱼在流水养殖系统中暂养 2 周, 暂养期间投喂 G0 组饲料, 使实验鱼适应养殖环境。将实验鱼随机分为 6 组, 每组3 个重复, 每个重复 40 尾幼鱼。每组分别饲喂表 1中的 6 组饲料, 每天投喂2次, 投喂时间分别为 8:00和 18:00, 实验周期为8周。在实验过程中全程保持曝气, 水温维持在 23—29℃, 溶解氧 ≥6.5 mg/L,pH 7.0—7.3。

实验开始前称取杂交黄颡鱼幼鱼体长与体重。在养殖实验结束时, 禁食 24h 后取出每个养殖缸中的所有实验鱼, 以 MS-222 溶液麻醉, 然后计数并称重, 测量鱼体体长, 每平行随机捞取12条鱼,其中6条直接置于−80℃ 保存, 用于测定全鱼常规营养成分, 其余幼鱼使用注射器尾静脉采血置于离心管中, 之后解剖得到肝脏和内脏并分别称重。采集的血液样本经过静置并于 3000 r/min离心 15min,取上清液即为血清。将得到的肝脏与血清样本立即使用液氮冷冻, 并在取样结束后转入−80℃ 冰箱进行保存, 用于之后测定抗氧化指标。测定之前将肝脏组织以体积 1∶9 加预冷生理盐水并匀浆, 在4℃下 3000 r/min 离心 10min, 取上清液, 按比例稀释后用于抗氧化酶活性分析。

1.3 测定指标与计算方法

常规营养指标的测定全鱼及饲料常规营养成分使用以下方法进行分析: 水分含量采用 105℃烘干法, 粗蛋白含量通过凯氏定氮法测定, 粗脂质通过索氏抽提法测定, 粗灰分使用马弗炉在 550℃高温烧灼测定。氨基酸测定采用酸水解法(色氨酸用 NaOH 水解)测定。

抗氧化酶活性的测定血清和肝脏谷胱甘肽还原酶(GR)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、总抗氧化能力(T-AOC)测定采用南京建成生物工程研究所的试剂盒, 具体测定方法见试剂盒说明书。

指标计算增重率(Weight gain rate,WGR, %) =100×(终末均重−初始均重)/初始均重

特定生长率(Specific growth rate,SGR, %/d)=100×(ln 终末均重–ln 初始均重)/养殖天数;

饲料系数(Feed Conversion ratio,FCR)=摄食饲料干重/(终末均重−初始均重)

存活率(Survival rate,SR, %)=100×终末尾数/初始尾数

脏体比(Viscerosomatic index,VSI)=100×内脏重/终末体重

肝体比(Hepatosomatic index,HSI)=100×肝脏重/终末体重

肥满度(Condition factor,CF, g/cm3)=100×体重/体长3

1.4 统计分析

所有数据均使用 SPSS Statistics 19 软件进行单因素方差分析(ANOVA), 差异显著时(P＜0.05)通过 Duncan 氏检验进行多重比较分析, 所有结果均以(平均值±标准差)表示。

2 结果

2.1 蝇蛆粉替代鱼粉对杂交黄颡鱼生长性能的影响

如表 3所示, 各处理组杂交黄颡鱼存活率无显著性差异, 且均大于 95%。增重率(WGR)与特定生长率(SGR)出现了下降的趋势, 其中G20、G40与G0相比,WGR与SGR没有显著性差异(P＞0.05), 当替代水平高于 60% 时, 杂交黄颡鱼WGR与SG显著下降(P＜0.05), G60、G80与G100组增重率(WGR)的下降比例分别为9.32%、13.01%与15.24%。与G0相比, G20与G40的饲料系数(FCR)没有显著性差异(P＞0.05), 当替代水平高于60% 时, 饲料系数显著升高, G60、G80与G100组的升高比例分别为 9.32%、13.56%与16.10%。各组实验鱼的肝体比(HSI)、脏体比(VSI)与肥满度(CF)均未出现显著性差异(P＞0.05)。HSI为1.34%—1.53%, 且G0与G20组的HSI大于其余各组(P＞0.05);VSI为8.60%—9.82%,G0、G20与G40组的VSI大于其余各组(P＞0.05);CF为1.50%—1.63%。如图 1所示,SGR和饲料中蝇蛆蛋白的水平关系呈现先上升后下降的趋势(R2=0.9911)。

表 3 蝇蛆粉替代鱼粉对杂交黄颡鱼生长性能的影响Tab. 3 Effects of fishmeal replacement by maggot meal on growth performance of juvenile hybrid yellow catfish

2.2 蝇蛆粉替代鱼粉对杂交黄颡鱼体组成的影响

从表 4可知, 不同水平蝇蛆粉替代鱼粉后全鱼体组成包括水分、粗蛋白、粗脂肪与粗灰分各组之间没有显著性差异(P＞0.05)。水分含量为74.74%—76.27%; 粗脂肪含量为 4.65%—4.78%, 其中高水平替代组即G80与G100的全鱼粗脂肪较其他处理组表现出下降趋势(P＞0.05), 但差异不显著,粗蛋白含量为 13.98%—14.51%, 粗灰分含量为2.19%—2.42%。

2.3 蝇蛆粉替代鱼粉对杂交黄颡鱼抗氧化酶活性的影响

如表 5所示, 在肝脏中, CAT、GR、SOD和TAOC均出现了先上升后下降的趋势。肝脏CAT活性在 G40 组最高, 且显著高于G0组(P＜0.05), 在G100组最低, 显著低于其他组(P＜0.05)。肝脏GR与SOD活性则在 G20 组最高, 但与G0组相比并未出现显著性差异(P＞0.05), 随着替代比例的升高,G60、G80与G100组的GR与SOD活性显著低G0与G20组(P＜0.05)。与G0相比, G20与G80组的MDA没有显著性差异(P＞0.05), G40、G60组的MDA显著下降, G100组的MDA显著升高(P＜0.05)。T-AOC在G60组最高, 显著高于其他替代组(P＜0.05)。

血清中CAT、GR和SOD出现了先上升后下降的趋势。血清CAT在G60组最高, 且显著高于其他替代组(P＜0.05)。血清 GR 在替代水平小于 80%时, 各组之间没有显著性差异, G100组GR活性显著低于其他替代组。血清SOD活性在G20组最高, 但与G0组相比并未出现显著性差异(P＞0.05), 随着替代比例的升高, G60、G80与G100组的SOD活性显著低于G0与G20组(P＜0.05)。血清与肝脏中MDA呈现先下降后上升趋势, 且当替代比例大于40%时, 肝脏中 MDA显著小于G0(P＜0.05), G100组血清与肝脏MDA显著大于G0组。血清T-AOC呈现下降趋势, 替代比例大于40%时, 与对照组相比, TAOC显著下降(P＜0.05)。

3 讨论

3.1 蝇蛆粉替代鱼粉对杂交黄颡鱼生长性能的影响

在本实验条件下, 蝇蛆粉的替代水平低于 40%时, 杂交黄颡鱼的生长性能没有显著性差异, 当替代水平大于 60% 时, 杂交黄颡鱼的生长性能显著降低。使用昆虫蛋白源替代鱼粉在普通黄颡鱼的研究中, 蝇蛆粉替代水平为 20% 时, 黄颡鱼的生长性能没有显著性差异, 大于 20% 时, 黄颡鱼的生长性能显著下降[22]; 黑水虻粉替代水平小于 30% 时,黄颡鱼的生长性能没有显著性差异, 替代水平大于30% 时, 黄颡鱼的生长性能显著下降[23]; 黄粉虫粉与蚕蛹粉完全替代鱼粉, 黄颡鱼的生长性能显著下降[24]。综合上述研究结果表明, 昆虫蛋白在一定替代水平内, 不会影响黄颡鱼的生长性能, 而使用过高水平的昆虫蛋白源替代鱼粉会导致黄颡鱼生长性能降低。然而, 使用黑水虻粉完全替代饲料中的鱼粉不会对大西洋鲑(Salmo salar)的生长性能产生显著的负面影响[10]。同时在一些研究中, 使用其他昆虫蛋白部分替代鱼粉时, 金头鲷(Sparus aurata)和尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)的生长性能得到改善[14,26]。这些结果的差异可能与不同的鱼类所需的必需氨基酸(EAA)模式和对氨基酸利用的差异相关[26]。在本研究中, 蝇蛆粉的必需氨基酸模式与鱼粉较为相似(表 2), 但是当蝇蛆粉完全替代鱼粉时, 饲料中的亮氨酸和精氨酸含量低于其他组,这可能是高水平蝇蛆粉替代鱼粉处理组实验鱼表现出生长性能降低的主要原因。另外, 蝇蛆粉的蛋白质质量受到蝇蛆的饲养条件和加工方法及其他因素的限制, 这些可能也会对幼鱼的生长性能产生影响。同时, 昆虫体内含有一定的几丁质, 而一般认为鱼类不能消化几丁质[27]。随着替代水平的提高, 饲料中几丁质含量也在增加。有研究表明, 鱼类摄入过多的几丁质可能会降低饲料中脂质和蛋白质的消化率, 从而降低营养利用率, 影响鱼类的生长性能[12]。

图 1 饲料中蝇蛆蛋白水平对杂交黄颡鱼特定生长率(SGR)的影响Fig. 1 The effect of replacement level of maggot meal level in diet on SGR (%/d) in hybrid yellow catfish

3.2 蝇蛆粉替代鱼粉对杂交黄颡鱼形体指标与全鱼体组成的影响

在本实验中, 全鱼水分、粗蛋白、粗脂肪和粗灰分这些体组成指标各组之间均没有显著性差异,这一结果与非洲尖齿胡子鲶(Clarias gariepinus)的投喂实验相似[28]。全鱼的蛋白质含量通常相对稳定, 鱼体的粗蛋白含量不会显著变化, 而脂肪含量往往会随着饲料中脂肪含量或种类的变化而发生变化。在对大菱鲆幼鱼(Psetta maxima)的试验中,当黑水虻对鱼粉的替代水平达到 64% 时, 饲喂 56d后全鱼的粗脂肪含量显著降低[7], 作者将这一结果归因于2种蛋白源的脂肪类型不同, 而鱼体对不同种类脂肪的利用率存在差异。Panini 等[29]则在研究中发现, 当黄粉虫对鱼粉的替代比例高于 25%时, 太平洋白虾的粗脂肪含量显示出增加的趋势,而这一结果的出现则由于随着替代水平的升高, 饲料中脂肪化含量随之升高。Fasakin等[30]使用了不同加工方法生产的全脂和脱脂的蝇蛆粉来代替鱼粉, 结果表明不同的加工方法与蛋白源的脂肪含量均会对非洲尖齿胡子鲶的粗脂肪结果产生不同的影响。这些均表明昆虫蛋白的脂肪水平和脂肪类型都可能影响鱼体组成中粗脂肪的含量。

表 4 蝇蛆粉替代鱼粉对杂交黄颡鱼全鱼体组成的影响(%湿重)Tab. 4 Effects of fishmeal replacement by maggot meal on body composition (% whole body weight) of juvenile hybrid yellow catfish

表 5 蝇蛆粉替代鱼粉对杂交黄颡鱼抗氧化酶活性的影响 (U/g prot)Tab. 5 Effects of fishmeal replacement by maggot meal on antioxidase of juvenile hybrid yellow catfish (U/g prot)

3.3 蝇蛆粉替代鱼粉对杂交黄颡鱼抗氧化酶活性的影响

抗氧化酶系统是一种抗氧化防御机制, 可防止由活性氧引起的损害并维持自由基产生和清除之间的平衡, 包括谷胱甘肽过氧化物酶(GPX), 过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)[31]等。谷胱甘肽还原酶(GR)是体内重要的抗氧化酶。它利用还原的 NAD(P) 催化 GSSG 转化为 GSH, 从而为去除细胞内活性氧(ROS)提供了还原能力[32]。SOD 则可以清除机体内的活性氧自由基, 将其转化为H2O2, 再通过 CAT 进一步还原生成 H2O 和 O2。丙二醛(MDA)是机体中的脂质过氧化物的最终产物, 间接反应机体受自由基攻击的严重程度。同时总抗氧化能力(T-AOC)也是反映机体抗氧化能力的重要指标之一。

在本研究中, 替代水平到达 40% 时, 肝脏中的CAT 与 T-AOC 活性显著升高, 肝脏MDA 含量显著降低。而当替代水平高于 80% 时, 血清与肝脏中多种抗氧化酶活性均显著降低, MDA含量显著升高。一般来说, 血清中各项抗氧化酶活性的升高代表鱼体的抗氧化能力增强。昆虫粉替代鱼粉往往会对鱼类的抗氧化系统产生不同的影响。有研究表明, 黄粉虫粉可以改善虹鳟(Oncorhynchus mykiss)肠道中的抗氧化酶活性(SOD、CAT、GPx和GR)[33]。Ogunji等[14]使用蝇蛆粉替代鱼粉时, 并未对尼罗罗非鱼的 CAT 活性造成显著影响。而在一项异育银鲫(Carassius auratus gibelio)和瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus vachelli)的饲养实验中, 当蝇蛆粉替代鱼粉时, 抗氧化酶活性在两种鱼中表现出了相反的结果[34]。以上研究进展表明, 不同物种对食物中不同蛋白质的应答采取了不同防御策略。

在本实验中, 当替代水平等于 40% 时, 蝇蛆粉替代鱼粉对杂交黄颡鱼的抗氧化能力有一定提高作用, 这与蝇蛆蛋白中的几丁质、抗菌肽、凝集素和溶菌酶等免疫活性物质有关, 这些成分可以对幼鱼的抗氧化能力产生积极影响[35]。然而, 随着替代水平的提高, 幼鱼的抗氧化能力开始显著下降。造成这一现象可能原因为: 随着替代水平的升高, 饲料中亮氨酸和精氨酸的含量呈下降趋势。亮氨酸(Leu)是鱼类必需的支链氨基酸(BCAA), 具有调节蛋白质代谢和增强免疫力等生理功能[36]。有研究表明, 亮氨酸可以增强草鱼肌肉和肠道的抗氧化能力[37], 缺乏亮氨酸可能会导致高水平替代饮食中抗氧化酶活性的降低。T-AOC 是一项评估组织与血清抗氧化能力的指标, 代表包括酶类与非酶类物质的综合水平。在本实验中, G40 组的 T-AOC 在血清中与肝脏中呈现了相反的趋势, 分析可能的原因为, 肝脏是鱼类抗氧化系统的重要靶器官, 当机体氧自由基产生的时候, 肝脏发挥作用, 所以肝脏中的 T-AOC 升高, 但血清中的 T-AOC 含量反应的是机体包含各组织器官中 T-AOC 的整体水平, 在G40 阶段, 可能其他器官已经造成了一定损伤, 血清中 T-AOC 降低, 而当替代水平大于 60% 时, 肝脏达到了其对氧化物质的调节阈值, T-AOC 出现下降趋势。由于蝇蛆蛋白中的氨基酸含量受养殖与加工环节影响较大, 在使用蝇蛆粉替代鱼粉之前,应考虑原料中各种氨基酸的平衡。

4 结论

使用蝇蛆粉替代鱼粉, 替代水平为 40% 时可以提高杂交黄颡鱼肝脏中抗氧化酶的活性, 但不会影响杂交黄颡鱼的生长性能、形体指标与体组成。当替代水平大于 60% 时, 杂交黄颡鱼生长性能开始显著降低, 肝脏与血清中 SOD 活性显著降低。实验结果表明蝇蛆蛋白可以替代40%左右的鱼粉蛋白, 但有关大量替代造成生长性能与抗氧化酶活性降低的原因还有待进一步研究。