Mito-Tempo在LPS诱导的肺动脉内皮细胞损伤中的作用*

张立新，王晓颖，和思燏，白君娥，朱祥瑞，梅 健，马 翠△

（1哈尔滨医科大学大庆分校医学检验与技术学院，2黑龙江省慢性病基础研究与健康管理重点实验室，黑龙江大庆163319；3哈尔滨医科大学药学院，黑龙江哈尔滨150081）

肺动脉高压（pulmonary hypertension，PH）是一种与炎症相关的进行性血管损伤性疾病，其病理特性主要是持续性的肺血管收缩，肺循环阻力增强，右心室肥厚，最终导致右心衰竭和死亡［1-3］。PH的发病机制与肺动脉内皮细胞（pulmonary arterial endothelial cells，PAECs）的不稳定有关，在病理状态下内皮细胞能释放大量活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），可通过调节不同类型的激酶和磷酸化酶，促进黏附连接蛋白和肌动蛋白的细胞骨架磷酸化，导致血管内皮细胞通透性增加，引起内皮细胞及血管损伤［4-6］。线粒体动态变化参与内皮细胞的多个生理进程如细胞内的钙平衡、ATP生成、ROS产生及氧化应激，其中线粒体产生的ROS是诱导内皮细胞炎症反应的主导因素，在维持内皮细胞功能的稳定性方面扮演着重要角色［7-10］。Mito-Tempo是具有超氧化物和烷基自由基清除特性的线粒体靶向抗氧化剂，其在PH中的作用，特别是能否减轻PAECs的功能障碍仍有待研究。本研究拟通过构建脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）诱导的PAECs炎症损伤模型，探讨Mito-Tempo对PAECs的保护作用及其分子机制。

材料和方法

1 主要试剂

Tempol和Mito-Tempo购于Enzo Life Sciences；MTT、RIPA蛋白裂解液、HRP标记的山羊抗兔IgG、HRP标记的山羊抗小鼠和GreenNuc™活细胞caspase-3活性检测试剂盒购于碧云天生物技术有限公司；Transwell小室和Matrigel购于BD；抗发动蛋白相关蛋白1（dynamin-related protein 1，Drp1）、p-Drp1和电压依赖性阴离子通道（voltage-dependent anion channel，VDAC）抗体购于Abcam；四甲基罗丹明甲酯（tetramethylrhodamine methyl ester，TMRM）与MitoSOX购于Thermo Fisher。

2 实验方法

2.1 牛PAECs的原代培养与鉴定本研究获得哈尔滨医科大学伦理委员会的批准。取新生小牛肺脏放于超净台内，手术剪分离出肺主动脉，放置在HEPES缓冲液中清洗，使用手术刀片轻轻地刮下肺主动脉内皮层，放入胶原酶中消化30 min，1×PBS洗掉胶原酶，用含20%胎牛血清的DMEM培养液培养，置于37℃、5%CO2条件的培养箱中，3 d后观察细胞生长情况，待细胞长到80%左右传代，进行后续实验。通过显微镜下细胞形态特征和细胞免疫荧光染色检测内皮标志物CD31来鉴定PAECs。

2.2 MTT实验将密度为每孔5 000个细胞的PAECs接种到96孔培养板中并置于37℃、5%CO2的条件下培养，待细胞长到80%左右时饥饿处理过夜，按实验分组进行相应处理，继续培养24 h，向细胞中加入含有0.5%MTT的无色培养基，避光温育4～6 h，弃去培养液并向细胞中加入150μL DMSO，振荡，10 min后终止反应，用酶标仪测定波长490 nm处的吸光度（A）。

2.3 细胞划痕实验将处于对数生长期的PAECs接种到6孔培养板中并置于37℃、5%CO2的条件下培养，待细胞长满，饥饿处理过夜，用100～200μL移液管枪头轻划出一道1 mm宽痕，1×PBS清洗后按实验分组进行相应处理，在0 h和24 h后对相同的划痕区域进行拍照。

2.4 Transwell实验将滤膜孔径为8μm的Boyden小室置于24孔培养板中，小室下层加入5%FBSDMEM培养基。将处理好的PAECs用胰蛋白酶消化处理并重悬于无血清培养液中，然后按照细胞数为每孔8×104接种到Boyden小室上室中，加药处理后置于37℃、5%CO2条件下培养24 h。随后取出小室，用棉签轻檫掉小室上层未迁移的细胞。将迁移细胞用4%多聚甲醛室温固定15 min，0.4%结晶紫染色10 min，蒸馏水清洗3遍，显微镜观察并拍照计数。

2.5 小管形成实验在96孔培养板中加入30μL提前融化成液体的Matrigel，并在37℃下固化30 min。将PAECs用胰蛋白酶消化处理并制成浓度为5×107/L的细胞悬液，吸取200μL细胞悬液接种于每个孔中，按实验分组进行相应处理后置于37℃、5%CO2条件下培养24 h。显微镜下观察小管形成后拍照，Image-Pro Plus 6.0软件测定小管长度。

2.6 MitoSox与TMRM染色将按实验分组进行相应处理后的PAECs与MitoSOX™Red线粒体超氧化物指示剂（5μmol/L）或TMRM（0.1μmol/L）37℃避光孵育20～30 min，PBS清洗3遍。使用尼康TE2000显微镜观察拍照（激发波长514 nm/发射波长585 nm）。

2.7 线粒体形态及氧化状态检测将线粒体靶向表达氧化还原反应敏感性GFP的Mito-roGFP转染细胞，作用24 h后使用激光共聚焦显微镜拍照观察线粒体形态。将获得的图像使用ImageJ软件进行线粒体片段化量化分析，以线粒体片段化指数（mitochondrial fragmentation index，MFI）表示。使用多边形选择工具选择单个的细胞，复制并转移到新的独立图像文件中。转换线粒体图像为8位灰度图像。调整合适的图像阈值，使线粒体的成像明显区别于背景。将图像转换为二值图像，计算非连续的线粒体片段的数量和线粒体中的像素数量。MFI的计算方法是将非相邻片段数除以像素数，再乘以1 000［11］。为了确定细胞的氧化还原状态，细胞分别给予405 nm和488 nm波长激发光激发，随后于525 nm波长处获取荧光照片。每分钟对单个细胞进行成像，持续30 min，并测量405 nm（氧化）和488 nm（还原）荧光强度的比值以确定每个细胞的相对氧化还原状态。

2.8 细胞免疫荧光观察将预先处理好的细胞使用1×PBS清洗3遍，4%多聚甲醛4℃固定15 min，1×PBS清洗3遍，0.01%Triton X-100室温孵育细胞10 min透化细胞膜，1×PBS缓冲液清洗3遍，5%BSA封闭细胞30 min后，将Ⅰ抗（抗Drp1抗体，1∶50）滴加到细胞上，4℃孵育过夜。第2天PBS清洗3遍，Ⅱ抗（Cy3）37℃避光孵育2 h，1×PBS清洗3遍，DAPI避光室温染核10 min，PBS缓冲液清洗3遍。使用尼康TE2000显微镜观察拍照。

2.9 Western blot实验将预先处理好的细胞使用PBS缓冲液清洗3遍，吸尽PBS缓冲液，加入带有PMSF的蛋白裂解液，冰上孵育15 min，刮刀收集细胞裂解液，4℃、13 500 r/min离心15 min，吸取上清液即是细胞总蛋白。取30～50μg蛋白样品，按照每100μL蛋白加入25μL 5×SDSLoading Buffer，混匀，放在100℃煮样器中5 min，-80℃保存。按照实验分组加入不同的蛋白样品和蛋白Marker，10%Tris-HCl SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离，并转移到硝酸纤维素膜上转膜2 h，按照分子量剪膜后5%脱脂奶粉室温封闭1 h，4℃孵育Ⅰ抗（抗β-actin抗体，1∶1 000；抗Drp1和p-Drp1抗体，1∶500）过夜。第2天孵育不同比例的Ⅱ抗（HRP标记的山羊抗兔IgG和HRP标记的山羊抗小鼠IgG，1∶5 000～1∶10 000），室温孵育1 h。用ECL工作液室温孵育NC膜5 min后显影使用ImageJ软件分析目的蛋白相对密度。

2.10 caspase-3活性的检测将密度为每孔5 000个细胞的PAECs接种到96孔培养板中并置于37℃、5%CO2的条件下培养，待细胞长到80%左右时饥饿处理过夜，按实验分组进行相应处理继续培养24 h。按照GreenNuc™活细胞caspase-3活性检测试剂盒说明书要求进行样品处理，用酶标仪测定波长490 nm处的A值。

3 统计学处理

用SPSS 16.0统计软件进行分析。所有数据均采用均数±标准误（mean±SEM）表示。两组间比较采用t检检，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 LPS诱导PAECs损伤，凋亡增加

MTT实验检测不同浓度（0、0.1、1和5 mg/L）的LPS作用24 h对PAECs活力的影响，结果表明LPS浓度为1 mg/L时，细胞开始出现明显损伤，见图1A。同时通过caspase-3活性测定实验检测不同浓度（0、0.1、1和5 mg/L）的LPS作用24 h对PAECs凋亡的影响，结果显示细胞凋亡程度随着LPS浓度的升高而显著增强，见图1B。综合以上两个实验结果选定1 mg/L LPS为后续实验条件。

Figure 1.LPSinduced apoptosis of PAECs.A：the viability of PAECs after treatment with different concentrations of LPSfor 24 h was detected by MTT assay；B：the apoptosis of PAECs after treatment with different concentrations of LPSfor 24 h was measured by caspase-3 activity detection assay.Mean±SEM.n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs0 mg/L group.图1 LPS诱导凋亡，促进PAECs损伤

2 LPS诱导PAECs氧化应激及线粒体功能异常

PAECs转染Mito-roGFP腺病毒后检测细胞线粒体形态和氧化状态，如图2A所示，LPS诱导细胞线粒体分裂，线粒体片段化增加，同时促进线粒体氧化应激。线粒体膜电位测定结果显示，LPS导致PAECs的线粒体去极化，见图2B。同时线粒体ROS荧光探针MitoSOX染色结果显示，LPS诱导线粒体中ROS产量增加，见图2C。以上实验结果表明，LPS诱导氧化应激，损伤PAECs的线粒体形态和功能。

Figure 2.LPSinduced oxidative stress and mitochondrial dysfunction of PAECs.A：mitochondrial fission［indicated by mitochondrial fragmentation index（MFI）］and oxidative status（indicated by the ratio of fluorescence at 405/488 nm）of PAECs induced by LPSwere detected after infection with Mito-roGFP；B：tetramethylrhodamine methyl ester（TMRM）staining was used to assess mitochondrial polarization；C：representative images of mitochondrially targeted superoxide indicator Mito-SOX staining.Mean±SEM.n=5.**P＜0.01 vs control（CON）group.图2 LPS诱导PAECs氧化应激及线粒体功能异常

3 Mito-Tempo抑制LPS诱导的PAECs氧化应激及线粒体功能损伤

为了探究抗氧化剂Tempol和Mito-Tempo是否能够缓解LPS诱导的PAECs氧化应激及线粒体损伤，分别给予细胞Tempol及Mito-Tempo（10 mmol/L）处理［11］，Mito-roGFP腺病毒转染结果显示，Mito-Tempo明显抑制了LPS诱导的细胞线粒体片段化和氧化应激，但Tempol抑制效果相对较弱，见图3A。另外，我们发现LPS+Mito-Tempo组的线粒体去极化水平较LPS组显著下降，而LPS+Tempol组的线粒体去极化水平无明显变化，见图3B。MitoSOX结果表明，使用Mito-Tempo处理细胞后，与LPS组相比，细胞内ROS水平明显下降，见图3C。以上实验结果说明Mito-Tempo明显减轻LPS诱导的PAECs氧化应激及线粒体形态和功能损伤。

4 Mito-Tempo抑制LPS激活的Drp1磷酸化

为了确定LPS诱导的线粒体功能障碍是否与Drp1激活有关，我们采用细胞免疫荧光实验，红色荧光标记Drp1，绿色荧光标记线粒体标志蛋白VDAC。结果显示，Drp1在胞质及线粒体中大量分布，且LPS促进Drp1的表达，Tempol和Mito-Tempo处理可降低Drp1的表达水平，见图4A。同时，Western blot实验结果发现，Tempol和Mito-Tempo处理抑制了LPS导致的Drp1和p-Drp1蛋白水平升高，其中Mito-Tempo的抑制效果更为显著，见图4B。

5 Mito-Tempo减轻LPS诱导的PAECs凋亡

MTT实验检测结果表明，与LPS组相比，LPS+Mito-Tempo组的细胞活力明显增加（P＜0.05），LPS+Tempol组的细胞活力无明显改变，见图5A。同时caspase-3活性检测实验结果显示，与LPS组相比，LPS+Mito-Tempo组的细胞损伤减轻，但Tempol处理不能抑制细胞凋亡，见图5B。以上实验证明Mito-Tempo可显著抑制LPS引起的PAECs损伤。

6 Mito-Tempo抑制LPS导致的PAECs功能异常

Figure 3.Mito-Tempo（Mito-T）inhibited LPS-induced oxidative stress and mitochondrial dysfunction of the PAECs.A：the effect of Tempol（T）or Mito-T（10 mmol/L）on mitochondrial fission and oxidative status；B：the effect of Tor Mito-T（10 mmol/L）on mitochondrial polarization induced by LPS；C：MitoSOX staining was used to detect the effect of Tor Mito-T（10 mmol/L）on ROSproduction induced by LPS.Mean±SEM.n=5.**P＜0.01 vs control（CON）group；#P＜0.05 vs LPSgroup.图3 Mito-Tempo抑制LPS诱导的PAECs的氧化应激及线粒体功能损伤

PAECs的功能异常会导致其迁移及管腔形成功能受损［12］。划痕实验结果显示，经LPS诱导24 h后PAECs的迁移能力下降，划痕愈合程度明显低于正常组；Tempol和Mito-Tempo处理组较LPS组划痕愈合程度有所增加，且Mito-Tempo作用更为显著（P＜0.01），见图6A。Transwell实验结果显示，LPS诱导细胞穿过小室的数量明显少于正常组；LPS+Mito-Tempo组的细胞迁移能力有所增加；LPS+Tempol处理组与LPS组相比无明显改变，见图6B。小管形成实验表明，LPS刺激缩短了管腔形成长度；与LPS处理组相比，LPS+Mito-Tempo组的小管形成长度明显得到恢复，LPS+Tempol处理组的小管形成长度无恢复，见图6C。以上结果说明Mito-Tempo能明显抑制LPS导致的PAECs功能异常。

讨 论

血管内膜层的内皮细胞稳态破坏在PH肺血管重构的发展过程中发挥着重要作用［13］。在正常状态下，内皮细胞通过一种肌-内皮连接方式维护着平滑肌细胞的稳定，内皮细胞完整性对于维持血管正常的生理结构及功能具有重要的意义［14］。PH病变发生时，内皮细胞在通透性、抗凝作用和炎症反应等方面均发生显著变化，从而损伤了肺血管内皮细胞的结构和功能［15］。大量研究表明，炎症反应是导致PH发生发展的重要因素，一方面附着在内皮细胞上的炎症细胞可分泌大量炎症因子，从而导致内皮损伤；另一方面炎症细胞分泌的生长因子和趋化因子能促进平滑肌细胞的过度增殖和凋亡抑制，进而促进了PH的发展［16-17］。本研究发现LPS刺激PAECs导致细胞凋亡、迁移及管腔形成能力受损，进而对内皮细胞功能损伤的分子机制展开探索。

线粒体在细胞的正常生命进程中起着决定性作用，它参与细胞内各种信号的传递，调节细胞内氧化应激反应以及细胞增殖和凋亡过程［18-20］。大量研究表明Drp1是调控线粒体稳态的关键蛋白，炎症及缺氧等多种因素可导致Drp1的异常表达［21-22］。在病理条件下，细胞产生大量ROS，而ROS大部分来源于线粒体，线粒体内ROS的聚集会损伤线粒体的结构和功能，同时Drp1的表达及磷酸化增多，共同导致内皮细胞功能障碍［23-24］。因此，线粒体形态和功能异常是导致血管内皮受损的重要诱因。我们的前期研究显示线粒体ROS与Drp1的正反馈调节作用诱导缺氧性PAECs增殖，提示线粒体ROS与Drp1在PH疾病发病机制中具有重要作用。

Figure 4.Mito-Tempo（Mito-T）inhibits Drp1 expression and phosphorylation activated by LPS.A：the effect of Tempol（T）or Mito-T（10 mmol/L）on fluorescence of Drp1 induced by LPS；B：the effect of T or Mito-T（10 mmol/L）on the protein levels of Drp1 and p-Drp1 induced by LPS.Mean±SEM.n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control（CON）group；#P＜0.01，##P＜0.01 vs LPSgroup.图4 Mito-Tempo抑制LPS激活的Drp1表达和磷酸化

Figure 5.Mito-Tempo（Mito-T）attenuated apoptosis of PAECs induced by LPS.A：the effect of Tempol（T）or Mito-T（10 mmol/L）on the viability of PAECs induced by LPS；B：the effect of Tor Mito-T（10 mmol/L）on the apoptosis of PAECs induced by LPS.Mean±SEM.n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control（CON）group；#P＜0.05 vs LPSgroup.图5 Mito-Tempo减轻LPS诱导的PAECs凋亡

Figure 6.Mito-Tempo（Mito-T）inhibited the dysfunction of PAECs caused by LPS.A and B：scratch assay and Transwell method were used to detect the effect of Tempol（T）or Mito-T（10 mmol/L）on the migration ability of PAECs induced by LPS；C：the effect of Tor Mito-T（10 mmol/L）on the tube formation ability of PAECs induced by LPS.Mean±SEM.n=6.**P＜0.01 vs control（CON）group；##P＜0.01 vs LPSgroup.图6 Mito-Tempo抑制LPS导致的PAECs功能异常

Mito-Tempo是线粒体靶向抗氧化剂，其结构中含有氮自由基，具有类似于超氧化物歧化酶的活性，起到抗氧化应激的作用，同时易于转化成具有清除氧自由基作用的羟胺结构，进一步增加了其自身的抗氧化能力［25-26］。既往研究表明，Mito-Tempo在神经退行性疾病、糖尿病、心血管疾病等炎性疾病中都有一定的治疗效果，但其对于PH机制是否具有调控作用仍未明确［27-29］。

本研究证实LPS所致PAECs的功能障碍与线粒体稳态失衡密切相关。使用LPS刺激内皮细胞后，细胞线粒体分裂增多、氧化性增强、去极化水平升高、ROS产量增加以及Drp1表达活化增多；而给予Mito-Tempo处理能抑制LPS所致的线粒体分裂增多，并抑制氧化应激、线粒体去极化水平、ROS产量及Drp1表达和磷酸化，改善内皮细胞功能。根据以上研究结果，我们认为Mito-Tempo对内皮细胞具有保护作用，其机制可能依赖于Mito-Tempo的抗氧化应激能力，维持线粒体稳态，保护细胞免受氧化损伤。本实验初步探讨了Mito-Tempo对内皮细胞的保护作用及其分子机制，但体内实验中Mito-Tempo是否具有抑制PH发生发展的作用仍需要在未来的实验中加以验证。