lncRNA TDRG1通过调节miR-101-3p促进结直肠癌细胞增殖、侵袭和迁移*

王帅奇，孙 浩，张寿儒，陈利辉，陈秀峰，李 卫

（重庆大学附属肿瘤医院胃肠肿瘤中心，重庆400030）

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是全球发病率最高的肿瘤之一，每年有近160万例新发CRC病例［1］。CRC的存活率约为58%，并且一旦CRC进入晚期，手术切除是无用的，患者的预后极差［2］。尽管一些研究已经确定了许多与肿瘤发生有关的基因，但这些过程的分子机制尚不清楚［3-4］。因此，迫切需要进一步研究CRC发生发展的机制，寻找具有预后和治疗价值的新的治疗靶点。越来越多的研究表明，长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）在肿瘤的发展过程中起着关键作用，包括细胞增殖、细胞周期和转移［5-6］。最近的报告发现一些lncRNA在CRC的发展中起作用［7］。睾丸发育相关基因1（testicular development-related gene 1，TDRG1）是一种新发现的lncRNA，在多种肿瘤包括肺腺癌、甲状腺乳头状癌、宫颈癌和食管鳞状细胞癌中起原癌基因的作用［8-9］。然而，TDRG1在CRC中的作用尚未阐明。在本研究中，我们检测了CRC组织和正常组织中TDRG1的表达，并通过构建敲减TDRG1表达的CRC细胞模型，揭示TDRG1调节CRC细胞增殖、侵袭和迁移的机制。

材料和方法

1 临床组织标本

于2016年5月～2018年8月，在重庆大学附属肿瘤医院共收集40对CRC组织及相应的癌旁组织。标本冷冻保存在-80℃。

2 方法

2.1 细胞培养人正常结肠上皮NCM460细胞及CRC细胞系HT-29、SW480和LoVo购自ATCC。细胞培养在含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的McCoy′s 5A和高糖DMEM培养基（Gibco）中。

2.2 细胞转染由上海吉凯基因化学技术有限公司合成了抗TDRG1（sh-TDRG1）和非靶向对照（sh-NC）的慢病毒短发夹RNA（shRNA），miR-101-3p模拟物（pre-miR-101-3p）和miR-101-3p阻遏物（antimiR-101-3p）及其各自的非靶向序列（pre-NC或anti-NC）。使用Lipofectamine 3000试剂（Life Technologies）转染细胞。通过qPCR检测细胞过度表达和沉默的效率。

2.3 RT-qPCR实验使用Trizol试剂（Invitrogen）从细胞或组织中分离总RNA，并使用PrimeScript RT试剂盒（TaKaRa）将RNA反向转录成cDNA。RT-qPCR分析采用SYBR Green PCR试剂盒（TaKaRa）进行。U6用于标准化miR-101-3p的相对表达，和β-actin用于标准化TDRG1的相对表达。采用2-ΔΔCt法计算相对表达。TDRG1的正向引物序列为5′-CGGGAACAAGCCCTGTG-3′，反 向 引 物 序 列 为5′-CCGGCCCAAAGATGATG-3′；miR-101-3p的正向引物序列为5′-TGCACCTAAAAGGAG-3′，反向引物序列为5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6的正向引物序列为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物序列为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；β-actin的正向引物序列为5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′，反向引物序列为5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′。

2.4 CCK-8法检测细胞活力细胞以每孔2.5×103个细胞的密度接种于96孔板中，培养24、48、72和96 h后，在每个孔中加入10μL CCK-8分析剂（Dojindo）。继续培养2 h后，以0.1%的最终浓度加入DMSO，使用酶标仪在450 nm处检测溶液的吸光度（A）值。

2.5 集落形成实验将细胞以每孔1×103接种在6孔板中，并加入含10%FBS的DMEM培养基。转染2周后，用甲醇固定细胞，用0.1%结晶紫（Sigma）染色。在显微镜下计算可见集落数。

2.6 Transwell测定在迁移实验中，将细胞以每孔1×105的密度接种到24孔Transwell小室中，在上腔室中加入无血清培养基，在下腔室中加入完全培养基。孵育24 h后，将细胞用含有0.1%结晶紫的染料溶液染色。之后，使用显微镜拍摄照片，并从6个视野中随机计数细胞。对于侵袭实验，使用预先涂有BD BioCoat Matrigel的Transwell室（BD Biosciences）检测细胞侵袭能力，其余步骤与细胞迁移测试相同。

2.7 双萤光素酶报告基因检测通过双重萤光素酶报告基因确认TDRG1和miR-101-3p之间关系。用PCR扩增含有预测miR-101-3p结合位点的TDRG1片段，克隆到含有萤光素酶的报告载体中来构建TDRG1野生型（TDRG1-WT）。为了使预测的miR-101-3p结合位点在TDRG1内发生突变，将假定的结合位点序列替换为TDRG1突变型（TDRG1-Mut）。用Lipofectamine 3000将载体和pre-miR-101-3p共转染HEK 293T细胞。48 h后，通过细胞裂解提取样品以检测萤光素酶活性。

3 统计学处理

使用SPSS17.0进行分析。所有数据均以均数±标准差（mean±SD）表示，两组之间的差异通过Student′st检验进行了分析，多组间比较采用单因素方差分析以及Bonferroni事后检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 TDRG1在人CRC组织中的表达情况

应用RT-qPCR检测CRC组织中TDRG1的表达水平。如图1所示，与匹配的癌旁组织相比，在CRC组织中观察到TDRG1的表达水平显著增加（P＜0.01），见图1A。此外，我们检测了TDRG1在CRC细胞系中的表达，结果表明，与正常细胞NCM460相比，TDRG1在CRC细胞系HT-29、SW480和LoVo中明显上调（P＜0.05或P＜0.01），见图1B。TDRG1表达与肿瘤病理参数的关系分析显示，TDRG1表达与CRC的肿瘤深度、淋巴结转移及肿瘤大小呈正相关（P＜0.05），见表1。

Figure 1.TDRG1 was highly expressed in CRCtissues and cells.A：the expression of TDRG1 was analyzed by RT-qPCR（n=40）；B：the relative expression of TDRG1 in 3 colorectal cancer cell lines and normal NCM460 cells was analyzed by RT-qPCR（n=3）.Mean±SD.**P＜0.01 vs normal tissues；#P＜0.05，##P＜0.01 vs NCM460 group.图1 TDRG1在CRC组织和细胞中高表达

表1 TDRG1表达与肿瘤病理参数的关系Table 1.Relationship between TDRG1 expression and tumor pathological parameters

2 敲减TDRG1基因的表达对SW480细胞增殖及侵袭和转移能力的影响

为了探讨TDRG1在CRC进展中的作用，用敲减SW480细胞株中TDRG1表达（图2A）的方法检测细胞增殖及侵袭能力。如图2B、C所示，敲减TDRG1基因的表达抑制了SW480细胞的活力和集落形成能力（P＜0.01）。此外，sh-TDRG1转染可观察到迁移和侵袭细胞数量显著减少（P＜0.01），见图2D。

3 miR-101-3p是TDRG1的直接靶点

越来越多的证据表明，lncRNA可作为相应miRNA的ceRNA［10］。因此，利用生物信息学数据库Starbase 2.0预测miR-101-3p作为TDRG1的靶点（图3A），并通过双萤光素酶报告基因实验验证了二者关系（图3B）。随后，RT-qPCR分析显示，敲减TDRG1的表达上调了SW480细胞中miR-101-3p的水平（图3C）。此外，与正常组织相比，在CRC肿瘤组织中观察到miR-101-3p低表达水平（P＜0.05），见图3D。Pearson相关分析显示TDRG1与miR-101-3p呈负相关（R2=0.389，P＜0.01），见图3E。

4 TDRG1通过miR-101-3p调节CRC的进展

为了进一步探讨miR-101-3p是否参与TDRG1相关的CRC进展，使用miR-101-3p抑制剂转染到SW480细胞。图4A显示miR-101-3p抑制剂的显著抑制效率。CCK-8和集落形成实验的结果表明，miR-101-3p抑制剂减轻了敲减TDRG1表达导致的细胞活力和集落形成能力的降低（图4B、C）。此外，Transwell实验表明miR-101-3p抑制剂也减轻了敲减TDRG1表达引起的细胞侵袭能力的降低（图4D）。

讨 论

Figure 2.Knock-down of TDRG1 expression inhibited the proliferation，migration and invasion abilities of SW480 cells.A：knockdown efficiency of sh-TDRG1 transfection in SW480 cells；B and C：the proliferation of SW480 cells was detected by CCK-8 assay and colony formation assay；D：Transwell assay was used to detect the migration and invasion abilities of the cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs sh-NCgroup.图2 敲减TDRG1基因的表达抑制SW480细胞的增殖、迁移和侵袭能力

Figure 3.miR-101-3p was the direct target of TDRG1.A：the binding site between TDRG1 and miR-101-3p was predicted by Starbase 2.0；B：luciferase reporter assay confirmed the interaction between TDRG1 and miR-101-3p in HEK-293T cells；C：knock-down of TDRG1 expression promoted the expression of miR-101-3p in SW480 cells；D：the expression of miR-101-3p in tumor tissues was lower than that in normal tissues；E：there was a negative correlation between miR-101-3p and TDRG1 in CRCtissues.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs pre-NCcells；##P＜0.01 vs sh-NCgroup；△P＜0.01 vs normal tissues.图3 miR-101-3p是TDRG1的直接靶点

Figure 4.miR-101-3p mediated TDRG1 to regulate the occurrence and development of CRC.A：the knock-down efficiency of miR-101-3p in SW480 cell line was detected by RT-qPCR；Band C：the proliferation of SW480 cells was detected by CCK-8 assay and colony formation assay after transfection；D：the migration and invasion abilities of the cells were detected by Transwell assay.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs sh-NC+anti-NCgroup；#P＜0.05 vs sh-TDRG1+anti-NCgroup.图4 miR-101-3p介导TDRG1调控CRC的发生发展

CRC是第4大肿瘤相关死亡原因［10］。越来越多的证据表明，lncRNA在肿瘤进展中起重要作用，并且在CRC中发现了lncRNA的异常表达［11-12］。因此，需要明确lncRNA在CRC发生发展中的确切作用，以期在CRC治疗中寻找新的诊断生物标志物。TDRG1是一种新的lncRNA，在多种人类肿瘤中起致癌作用。最近已证实TDRG1通过调节miR-326/丝裂原激活的蛋白激酶1或miR-214-5p/SOX4促进宫颈癌细胞的生长、迁移和侵袭［8-9］。在NSCLC中，TDRG1通过调节miR3/ZEB1轴促进NSCLC细胞转移［13］。因此，在几种恶性肿瘤中，TDRG1被认为是有效的癌基因。然而，TDRG1在CRC中的作用尚未被探讨。在本研究中，我们首先确定TDRG1在CRC中是起促进癌症的lncRNA，并证明TDRG1在人CRC组织中被过度调节，其与CRC的肿瘤深度、淋巴结转移及肿瘤大小相关；其次，我们进行了功能丧失实验，以探讨TDRG1对CRC细胞恶性特征的影响。结果表明，敲减TDRG1的表达可抑制体外CRC细胞的增殖和侵袭，提示TDRG1可能作为CRC治疗的生物标志物。

先前的研究已经证明，lncRNA通过与miRNA竞争性结合而充当ceRNA来调节癌症相关基因的表达［14］。我们使用了生物信息学数据库（StarBase 2.0）分析确定了miR-101-3p可能与TDRG1相互作用，并通过随后的萤光素酶实验证实了这一点。miR-101-3p被报道为不同肿瘤中的肿瘤抑制miRNA，如乳腺癌、视网膜母细胞瘤、骨肉瘤、卵巢癌和肝细胞癌［15-16］。值得注意的是，Jin等［17］发现miR-101-3p在CRC组织中下调，miR-101-3p的表达增加抑制了CRC细胞增殖、迁移和侵袭。在这项研究中，我们在CRC肿瘤组织中观察到miR-101-3p低表达水平，并且Pearson相关分析显示TDRG1与miR-101-3p呈负相关。此外，转染miR-101-3p抑制剂部分减轻了敲减TDRG1表达引起的细胞增殖、迁移和侵袭能力的降低。总而言之，本研究发现的miR-101-3p在CRC进展中的表达模式和抑癌作用的研究结果与Jin等［17］的结果一致。因此，靶向TDRG1/miR-101-3p可能是治疗CRC的一种新途径。

综上所述，本研究证明TDRG1是CRC中的一个癌基因，并且与CRC的进展密切相关。敲减TDRG1的表达联合miR-101-3p过表达在体外具有抑瘤作用，且两者之间存在负相关。TDRG1/miR-101-3p可能在人CRC中发挥重要作用，为CRC的治疗提供了一个有前途的靶点。