基于网络药理学的枇杷叶抗肺纤维化机制研究

黄 靖，杨 磊，林大河，林素英，林海燕，包君丽*

(1. 莆田学院 环境与生物工程学院 福建省新型污染物生态毒理效应与控制重点实验室，福建 莆田 351100； 2. 青海大学 医学院，青海 西宁 810016)

肺纤维化(Pulmonary fibrosis, PF)是以成纤维细胞增殖及大量细胞外基质聚集并伴炎症损伤、组织结构破坏为特征的一大类肺疾病终末期改变[1]。肺纤维化的病因主要分为两类，一类为已知原因，主要为职业与环境吸入疾病，包括吸入无机粉尘、有机粉尘和各种刺激性有毒气体；另一类为未知原因，这组疾病称为特发性间质性肺炎，是间质性肺病中一大类[2]。肺纤维化严重影响人体呼吸功能，表现为干咳、进行性呼吸困难，且随着病情和肺部损伤加重，患者呼吸功能不断恶化[3]。肺纤维化发病率和死亡率逐年增加，诊断后的平均生存期仅2.8年，死亡率高于大多数肿瘤，被称为一“类肿瘤疾病”[4]。鉴于肺纤维化发病机制尚未完全明确，目前临床上尚无针对性西医药物[5]。

中医近年在治疗肺纤维化方面形成了自己的一些特点，也取得了一定的的成果[6]。中医古代文献中虽无与肺纤维化相对应的病名记载，但根据其临床表现可归为“肺痿”和“肺痹”范畴[7]。枇杷叶是治疗呼吸道炎症性疾病的常见中药材之一，具有悠久的历史。近些年来，枇杷叶在改善肺纤维化症状上疗效显著[8]。然而，目前枇杷叶对肺纤维化的相关作用机制尚未明确，使得临床作用的发挥具有很大局限性。

中药化学成分多、方剂中多种中药相互作用、实验周期长、工作量大，而且不能全面地进行靶标测试，无法系统地从化合物成分-靶点去验证。网络药理学是基于系统生物学，通过大数据挖掘的方法，对药物进行多成分、多靶点、多途径的网络作用关系分析，从科学、全面的角度分析药物治疗疾病的作用机制，为中医药的研究及应用提供方向[9]。分子对接是通过受体的特征以及受体和药物分子之间的相互作用方式来进行药物设计的方法，主要研究分子间(如配体和受体)相互作用，并预测其结合模式和亲合力的一种理论模拟方法[10]。

本研究运用网络药理学的方法筛选枇杷叶有效活性成分，预测治疗肺纤维化相关靶标和通路，构建“疾病-药物-成分-靶标”网络图，全面分析探讨枇杷叶治疗肺纤维化的可能作用机制，再利用分子对接技术对枇杷叶中活性成分与肺纤维化关键靶标蛋白进行模拟结合研究。

1 资料与方法

1.1 药物活性成分的收集

为收集枇杷叶的化合物成分，利用中药系统药理数据库和分析平台(TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/TCMSP.php)[11]，以“枇杷叶”为关键词在“Herb name”条目中检索其化学成分，根据药物化合物分子的ADME参数分析，结合到后期用药量化分析，设定口服生物利用度(Oral bio- availability，OB)≥30%，成药相似性(Drug Like，DL)≥0.18，筛选获得初步满足网络药理数据分析标准的化合物分子。

1.2 活性成分候选靶标对应基因的收集

为了收集枇杷叶主要化合物的相应靶点，采用了以下方法。首先，查询由TCMSP数据库所提供的潜在作用靶点蛋白全称，然后借助Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)[12]对潜在靶点进行基因名称的注释；同时将枇杷叶的潜在化合物分子按照名称通过Stitch数据库(http://Stitch.embl.de/，ver)[13]查询与其对应的靶点基因；下载由TCMSP查询得到的化合物分子MOL2的格式文件，依次输入到Swiss target prediction 数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)[14]查询相应靶点，最后将以上数据库查询结果整理合并，尽最大可能确保数据的完整性。

1.3 肺纤维化相关靶标基因的收集

检索人类基因组注释(Genecards)数据库(https://www.genecards.org/)[15]和《人类孟德尔遗传》(OMIN)数据库(https://omim.org/)[16]，以“pulmonary fibrosis”为关键词，将得到的疾病相关基因进行整理，作为肺纤维化疾病相关基因。

1.4 活性成分-作用靶标网络构建与分析

剔除掉重复及与疾病没有相关性的靶点，再将剩余的药物活性成分与肺纤维化治疗作用靶标及相关通路构建相应的数据表，以构建的关系数据表作为Cytoscape 3.7.2的输入文件构建化合物成分及潜在作用靶点网络图，展示药物活性成分与作用肺纤维化靶标间的作用关系。

1.5 靶蛋白互相作用网络图构建

将枇杷叶治疗肺纤维化的潜在作用靶标导入String数据库(https://string-db.org/)[17]，限制物种为“Homo sapiens”，获取蛋白互作关系，以“TSV”格式导出结果。将所得数据导入 Cytoscape3.7.2 软件进行可视化处理，通过Network analyzer工具进行网络分析从而获得 Degree值，绘制蛋白互作(Protein-protein interaction，PPI)网络图，并以PNG格式导出。

1.6 基因本体富集(Gene ontology，GO)及特定物种种属代谢通路 (Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)分析

将枇杷叶治疗肺纤维化潜在作用靶标基因利用R语言的Clusterprofile程序包进行GO基因富集分析和KEGG通路富集分析，设定P_Value≤0.05得到相应的生物学过程及KEGG通路相关数据，然后将所得KEGG数据导入Cytoscape 3.7.2进行可视化图形绘制。

1.7 分子对接

从PDB蛋白质数据库(http://www.pdb.org/)下载枇杷叶重要化合物结合的候选蛋白质的晶体结构，并用MOE软件进行修饰，以去除配体、添加氢、去除水、优化和修补氨基酸，并使所有候选靶点的能量最小化。我们使用MOE来测试枇杷叶化合物与候选靶蛋白之间的对接精度，因为它具有较高的准确性和一致性。整体评估的最终得分是E_score = 2，对应的数值越小，分子之间的结合能越小，这意味着两者之间有较好的结合性(一般小于-5)。同时，用不同的颜色标记小分子的结构，我们可以观察到两者之间的结构空间有较大的重复区域，这证明了小分子构象与配体之间有很大的相似性。

2 结 果

2.1 枇杷叶选活性成分及候选靶标

通过TCMSP数据库检索得到枇杷叶活性成分共304个，再根据药物动力学特点设定阈值OB≥30%，DL≥0.18后，筛选出枇杷叶候选成分18个(见表1)，同时在平台检索这些候选活性成分的靶标，共134个。由Swiss Target Prediction数据库获取的靶标共有560个，筛选Probability大于0后共351个。将两个数据库搜索得到的靶标汇总去重后共有靶标464个。

表1 枇杷叶候选活性成分

续表1 枇杷叶候选活性成分

2.2 药物活性成分治疗肺纤维化候选靶标预测

人类基因组注释数据库中肺纤维化相关基因786个，OMIM数据库所得肺纤维化相关基因218个，去重后共得肺纤维化相关基因960个。再将药物候选基因与肺纤维化相关基因取交集，获得可能与肺纤维化有关作用靶标103个。筛选过程见图1。

2.3 药物-化合物-疾病-靶标-通路网络构建

将枇杷叶活性成分和与肺纤维化的作用靶标导入Cytoscape 3.7.2软件，构建药物-化合物-疾病-靶标-通路网络图。所构建网络共包括152个节点，其中18个活性成分节点，103个作用靶标节点，2286条边线。通过图2可以看出枇杷叶主要通过多成分对应多靶标来发挥对肺纤维化治疗作用。

2.4 靶蛋白互作网络图

将枇杷叶治疗肺纤维化潜在作用靶标基因导入String蛋白互作网络数据库获取靶标蛋白互作关系图，将其导入Cytoscape 3.7.2软件，菜单栏选择tools，然后运用analysis network，配置节点大小和颜色以跟随degree进行连续性变化，再配置边的颜色和粗细跟随combine_score进行连续性变化，最后根据节点度数将靶基因布局为四个同心圆，最外围的节点度数小于20，第三层的靶基因节点度数介于20-39，第二层的靶基因节点度数介于40-59，最里层的节点度数大于等于60。此网络图共包括103个节点，1463条边，图中 Degree 越大则节点越大，颜色越深，根据靶蛋白互作网络图计算得出相关节点度数的平均值为31，选取节点度数大于31的靶点(共计42个)作为重点研究，如AKT1、VEGFA、IL6、EGFR、CASP3等，可认为这些个靶标与枇杷叶治疗肺纤维化相关性较大，见图3。

图1 枇杷叶作用肺纤维化靶点筛选Fig. 1 The target genes of pulmonary fibrosis on the treatment by E. japonica

图2 药物-化合物-疾病-靶点网络图Fig. 2 Compounds-disease targets-mechanism network

图3 靶蛋白互作网络Fig. 3 Drug Target Protein-Protein Interaction Networks

2.5 枇杷叶中活性成分对应潜在靶标基因生物功能及通路分析

GO富集分析结果显示：① 生物过程(Biological process，BP)分析富集基因数量较大的有活性氧代谢过程、活性氧代谢过程的正调控、活性氧代谢过程的调控、MAP激酶活性的调节对氧气水平的反应等(图4)，②细胞分组(Cellular component，CC)分析中富集基因数量较大的有膜筏、膜微区、膜区等(图 5)，③分子功能(Molecular function，MF)分析富集基因数量较大的有蛋白酪氨酸激酶活性胰岛素受体底物结合、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受体蛋白激酶活性丝氨酸型内肽酶活性等(图6)。KEGG通路富集分析结果显示，共138条通络(P_Value<0.05)，如AGE-RAGE信号通路、膀胱癌、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)等(图7)。

2.6 分子对接

为了验证肺纤维化中枇杷叶靶点的候选化合物，测试了23-trans-p-coumaryhormentic acid和以下潜在靶蛋白: EGFR(PDB：2JIV)、MMP2(PDB：4KWE)和MMP9(PDB：6ESM)之间的对接精度(图8)。对接分析结果表明，靶蛋白和对应的化合物分子的得分小于-5，表明靶蛋白和化合物分子之间有较好的结合性(表2)。

图4 生物过程分析Fig. 4 The BP analysis

图5 细胞分组分析Fig. 5 The CC analysis

图6 分子功能分析Fig. 6 The MF analysis

图7 KEGG通路富集分析图Fig. 7 KEGG pathway enrichment analysis diagram

图8 23-trans-p-coumaryhormentic acid(MOL012556)与EGFR、MMP2和MMP9的分子对接Fig. 8 Molecular docking between 23-trans-p-coumaryhormentic acid(MOL012556) and (A) EGFR(B) MMP2(C)MMP9

表2 化合物-靶蛋白结合数据表

3 讨 论

本研究结果显示，枇杷叶作用于肺纤维化的有效活性成分18个，潜在作用靶标103个。根据这些靶标进一步收集枇杷叶治疗肺纤维化的生物过程及富集通路，由此探究枇杷叶治疗肺纤维化的作用机制，为其治疗肺纤维化提供证据支持，更加有利于临床的应用，也为进一步的试验研究提供思路。

枇杷叶主要含有黄酮及其苷类化合物、三萜酸类化合物、有机酸类化合物、挥发油类化合物、无机元素及其他化合物[18]。已有报道表明，枇杷叶的主要活性成分枇杷叶三萜酸治疗宫颈癌疗效显著[19]。刘娟等[20]研究发现枇杷叶三萜酸能明显改善肺纤维化模型大鼠肺脏组织结构，减轻肺纤维化增生程度。杨雅茹等[21]的体外试验发现枇杷叶三萜酸可能通过抑制ɑ-SMA基因表达来阻断成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，可能通过降低Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、CTGF的过度表达，减少细胞外基质的沉积，也可能通过抑制ERK1/2蛋白磷酸化环节阻断ERK通路等3个机制阻断肺纤维化进程，发挥其抗肺纤维化的作用。黄艳等[22]的动物试验发现叶三萜酸能明显改善大鼠肺脏组织结构，减轻肺纤维化增生程度。

根据“靶蛋白互作网络图”以及文献资料分析可得，复方苦参注射液治疗宫颈癌可能通过作用白介素6(IL-6)、表皮生长因子受体(EGFR)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)等4个靶标来发挥作用。王书臣等[23]采用气管内注入博莱霉素造成人鼠肺纤维化模型。试验结果发现，模型组IL-6的浓度始终高于正常对照组及各治疗组，肺纤平能降低血清IL-6的浓度，提示IL-6是肺纤维化的治疗靶点。蔡琳等[24]的动物试验结果发现，EGFR RNAi组与纤维化组比较，肺组织EGFR mRNA表达和EGFR蛋白表达均显著下降；肺病理损伤较纤维化组减轻，肺羟脯氨酸含量显著减少；磷酸化EGFR蛋白表达亦较纤维化组明显减少，表明EGFR RNAi抑制了EGFR活化，减轻肺纤维化改变。任培中[25]动物试验发现肺纤维化组较对照组肺组织MMP9表达水平明显升高，中药初期干预组MMP9表达水平明显降低。王勇等[26]的动物试验结果发现，纤维化模型组大鼠MMP2表达水平过高，雄附方高、中、低剂量组MMP2表达水平过低，提示MMP2可能是肺纤维化的治疗靶点。

通过文献检索及KEGG通路富集分析可知，枇杷叶治疗肺纤维化主要涉及雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、表皮生长因子受体(EGFR)、核转录因子(NF-kappa B)、血管内皮生长因子(VEGF)和磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)等信号通路。任培中等[27]的动物试验结果表明通肺络补宗气方可通过调控mTOR/p70S6K信号通路来抑制肺成纤维细胞的增殖、生长，减少透明质酸、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原等细胞外基质的过度沉积，从而抑制肺纤维化的发生发展。杨伟源等[28]使用EGFR抑制剂吉非替尼对博来霉素所致小鼠肺纤维化进行干预，结果显示吉非替尼可通过调控EGFR/Foxo3a/Snail1信号通路从而减轻小鼠肺纤维化，提示EGFR/Foxo3a/Snail1信号通路是治疗肺纤维化的关键通路。杨善军等[29]的动物试验加味补阳还五汤可以调控NF-κB信号转导通路来抑制肺纤维化，提示NF-κB信号转导通路是治疗肺纤维化的关键通路。栾智华等[30]的动物试验结果表明黄芪甲苷可通过调控VEGF/VEGFR2信号通路来改善肺纤维化。张艳霞等[31]的动物试验发现补气活血通络方通过干预PI3K/AKT信号通路的活化，从而起到对抗纤维化的作用。

本研究所获取的枇杷叶治疗肺纤维化的主要活性成分为三萜酸类化合物。分子对接结果表明23-trans-p-coumaryhormentic acid与IL6、EGFR、MMP9和MMP2有较好的结合性，这些结果提供了进一步的证据，证明这4种蛋白在肺纤维化中作为23-trans-p-coumaryhormentic acid的治疗靶点。本研究这些靶蛋白是因为在PPI网络图中处于关键位置，同时它们参与了关键通路，结果提示它们在肺纤维化对化合物的反应中可能起关键作用。

4 结 论

本研究表明枇杷叶治疗肺纤维化的主要活性成分为黄酮及其苷类化合物、三萜酸类化合物、有机酸类化合物、挥发油类化合物、无机元素及其他化合物。这些活性成分通过作用于IL-6、EGFR、MMP-9、MMP-2等靶标以及调节mTOR、EGFR、NF-kappa B、VEGF、PI3K-Akt等信号通路发挥对肺纤维化的治疗作用从中可以看出枇杷叶治疗肺纤维化具有多成分、多靶点、多通路的特点。然而本研究未能对其他治疗肺纤维化的可能机制进行科学实验的证实，尚存在局限性，但可以为有关试验研究提供思路与方向。