侧柏叶、何首乌复合提取物防脱发功效研究

马世宏，单承莺，聂韡，束成杰

(南京野生植物综合利用研究院，江苏 南京 211110)

脱发是一种常见现象，分为生理性脱发和病理性脱发两种。生理性脱发指头发正常的脱落，而病理性脱发则是一种常见的毛发疾病。据不完全统计，目前中国约有2.5亿脱发人群，其中男女比例约为3∶2，且脱发群体的年轻化趋势越发明显[1]。脱发虽不属于严重疾病，但对人们的精神状态和心理健康会产生较大的影响。雄激素源脱发(Androgenetic Alopecia，AGA)是脱发常见的诱因之一，以头皮油腻、瘙痒、头屑增多、脱发等为主要表现，男女均会发生；其发病机制与雄激素分泌、遗传以及精神紧张、疲劳、熬夜等不良生活习惯有关，其中雄激素为主要诱因[2]。头部毛发生长严格地受雄激素的影响，雄性激素中的睾酮在毛囊处经5α-还原酶催化，变成活性更高的5α-二氢睾酮(DHT)，并且这种变化是不可逆的。DHT是引起脱发的重要原因，它能与毛囊细胞内特定受体蛋白结合，将特定基因活化，诱导生成特定蛋白质，从而阻碍毛发生长，进而产生永久性脱发[3]。

侧柏叶是柏科植物侧柏(Platycladusorientalis(L.) Franco)的干燥嫩枝叶，作为一味常见中药可用于治疗脱发。《中华本草》中有记载，用侧柏叶乙醇提取物涂擦毛发脱落部位，治疗160例，总有效率达77.5%[4]。这类传统中医药方或偏方中，一般采用外部涂抹等手段，通过促进头皮部位血液微循环，增加细胞养分、刺激毛囊生长等手段，达到治疗脱发的作用。近年来，已有不少相关报道以侧柏叶及其他药材作为复方制剂在治疗脱发方面的研究[5-7]，但对于其作用机理仍然少有报道。

何首乌为蓼科植物何首乌(PolygonummultiflorumThunb.)的干燥块根，自古有“乌须发”的功效，历来为治疗白发与脱发的重要药物。载自《积善堂方》的七宝美髯丹即含有何首乌[8]。有学者研究发现首乌生发丸治疗白发与脱发的疗效优于101章光生发液，并且无明显毒副作用[9]。有报道以首乌生发颗粒治疗斑秃、脂溢性脱发患者，总有效率97.6%，明显优于同类临床常用中成药[10]。何红梅等[11]研究指出何首乌提取物能诱导C57BL /6J 小鼠毛发生长，使毛囊细胞从休止期进入生长期，从而加速毛发生长。Zheng等[12]研究发现何首乌提取液能够明显促进体外培养的头皮毛囊细胞的生长。

本文以侧柏叶、何首乌为主要原料，参考传统药方制备其复合提取物，利用体外和体内试验方法，对其防脱发功效进行评估并阐明其可能的作用机制，为后续开发含有侧柏叶、何首乌成分的防脱生发个人护理产品提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

C57BL /6J 雄性小鼠(18-23 g)，SD雄性大鼠(250-300 g)，均为SPF 级，由上海杰思捷实验动物有限公司提供，动物许可证号：SYXK(沪)2017-0003。试验动物由本单位动物实验室饲养，饲喂常规饲料及饮用水，5～7 d待小鼠适应后，开始试验操作。

侧柏叶、何首乌生药材(南京先声药业有限公司)；米诺地尔搽剂(有效成分含量2%，四川美大康华康药业有限公司)；非那雄胺片(杭州默沙东制药有限公司)；睾酮、1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(美国Sigma公司)；NADPH、丙基羟苯酸酯、甲醇(色谱纯)、二氯甲烷(色谱纯)(国药集团化学试剂有限公司)；丙酸睾酮注射液(宁波第二激素厂)；注射用大豆油(铁岭北亚药用油有限公司)；小鼠睾酮酶联免疫检测试剂盒、小鼠雌二醇酶联免疫检测试剂盒(南京生物工程研究所)。

紫外分光光度计(上海光谱仪器有限公司)；冷冻低温离心机(美国Thermo Fisher公司)；高效液相色谱仪(美国安捷伦Agilen公司)；酶标仪(美国Thermo Fisher公司)；旋转蒸发仪(北京大龙RE100-Pro)。

1.2 试验方法

1.2.1 侧柏叶、何首乌复合提取物的制备

取干燥的侧柏叶、何首乌药材，粉碎，过20目筛，按质量比1∶1分别准确称取100 g，按照1∶15的料液比加入3000 g 浓度为50%(V/V)的乙醇溶液，加热回流提取3～4 h，趁热过滤，将收集的滤液用旋转蒸发仪减压浓缩至浸膏状，干燥称重，得76.44 g 复合提取物；将此提取物复溶于去离子水，配置成质量浓度200 mg/mL 的溶液，离心后取上清液经膜过滤，即得侧柏叶、何首乌复合提取物受试液母液，冷藏备用。

1.2.2 清除DPPH自由基试验

将DPPH配制成0.2 mmol /L溶液(即配即用)，然后吸取250 μL受试溶液于eppendorf管中，加入750 μL DPPH溶液，于室温下黑暗处反应，时间分别设定为30 min、60 min，于517 nm处测定光吸收值(A值)，n=3。

DPPH自由基清除率=1-(A样品-A空白)/A对照×100%

1.2.3 体外5α-还原酶抑制试验[13]

5α-还原酶的制备：取SD雄性大鼠6只，禁食12 h后处死，于低温解剖台上取出大鼠前列腺，剪碎并称重。按质量比1∶5的比例加入提前预冷的缓冲液(含0.32 mol/L蔗糖、0.1 mmol/L 二硫苏糖醇、1 mmol/L乙二胺四乙酸和0.2 mol/L磷酸盐缓冲液)，于匀浆器中快速制成匀浆，使用冷冻离心机离心(13000 r/min，10 min)，取离心后上清液(须弃去最上层脂肪层)，加入缓冲液定容至20 mL，分装至eppendorf管中，于-80 ℃冰箱中保存备用。

5α-还原酶活性测定：依次加入0.5 mL磷酸盐缓冲液、0.2 mL受试溶液、200 μL睾酮溶液(300 mg/L)和200 μL NADPH溶液(0.8 g/L)于具塞试管中，最后加入0.5 mL 5α-还原酶提取物，于37℃下反应30 min；反应结束后加入3 mL二氯甲烷停止反应并萃取睾酮，再加入0.25 mL丙基羟苯酸酯(100 mg/L)作为内标，离心(5000 r/min，10 min)。弃去上层水相，移取约1 mL有机相，蒸干，将残留物溶于1.5 mL甲醇中，吸取10 μL用高效液相法测定残留睾酮含量。阳性对照为0.05 mg/L非那雄胺组，同时设定5α-还原酶反应管和5α-还原酶空白管。

5α-还原酶抑制率=(R样品-R反应)/(R空白-R反应)×100%

式中，R为目标峰面积与内标峰面积之比。

1.2.4 小鼠防脱发试验

1.2.4.1 动物造模及分组给药[14]

按照试验设计，将60只C57BL /6J小鼠随机分为6组，分别为正常组、模型组、阳性组以及复合提取物高剂量组、中剂量组、低剂量组，每组各10只。试验前将丙酸睾酮注射液和注射用大豆油按1∶5(V/V)进行稀释，配制成浓度为5 g /L的丙酸睾酮溶液备用；正常组小鼠在身体背部皮下注射注射用大豆油，每日1次；其余各组在小鼠身体背部皮下均注射丙酸睾酮溶液造模，剂量为5 mg /(kg·d)。造模同时各组小鼠背部毛发区给予相应受试液涂抹：阳性组给予米诺地尔搽剂0.3 mL涂抹；复合提取物高、中、低剂量组给予质量浓度40、100 、200 mg/mL的复合提取物溶液0.3 mL涂抹；正常组及模型组给予0.3 mL蒸馏水涂抹，注射丙酸睾酮溶液和涂抹给药须连续进行10 w。

1.2.4.2 观察指标及测定结果

小鼠状态及脱发情况观察：观察各时间段各组小鼠的常规状态。从第5 w开始至试验结束，每天收集各组小鼠脱落毛发；在固定时间段用相同篦子梳理每只小鼠背部的毛发，脱落的毛发用镊子收集并称重，用于小鼠脱发程度的考察。

小鼠血清中睾酮、雌二醇的测定：试验10 W后，所有受试小鼠眼眶后取血， 4℃下离心(13000 r/min，10 min)，获取血清后分装，置于-80℃冰箱备用。使用ELISA试剂盒测定小鼠血清中睾酮、雌二醇含量(按试剂盒要求操作)。

所有试验数据均采用SPSS统计软件进行统计学分析，每两组间数据比较采用t检验，P<0. 05 为差异具有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 抗氧化测试

将侧柏叶、何首乌复合提取物母液，按照质量浓度梯度配置为4、20、40、100、200 mg/mL的受试液，DPPH自由基清除结果见图1。由图1可以看出，受试液在反应维持30 min和60 min 时，均具有明显的自由基清除率，且效果随受试液浓度增加而增加，呈现出明显剂量效应关系；同一质量浓度下，反应60 min 时清除效果优于30 min。

有研究表明侧柏叶提取物、何首乌提取物都具有一定的抗氧化能力[3,7]。本研究在 DPPH 自由基清除试验中，侧柏叶、何首乌复合提取液也显示出较强的抗氧化能力，并且两者之间可能产生了一定的协同增效作用。生发与脱发过程是头皮细胞被氧化与抗氧化程度动态平衡的结果，一方面，活性氧(Reactive oxygen species，ROS)有促进毛囊细胞增殖的作用[15]；另一方面，氧化应激反应又被认为是导致心理性脱发的主要原因之一[16]。DPPH自由基清除率是一种被广泛认可的物质抗氧化能力的评价指标。本试验结果显示侧柏叶、何首乌复合提取物在不同作用时长下，DPPH的清除率均随溶液质量浓度增加而升高，表明该复合提取物具有较好的抗氧化能力。

图1 不同质量浓度受试液对 DPPH 自由基清除率Fig.1 DPPH scavenge of samples with different concentration

2.2 对5α-还原酶的抑制作用

将侧柏叶、何首乌复合提取物母液按照质量浓度梯度配置为4、20、40、100 mg/mL的受试液。试验结果表明，不同质量浓度的受试液对5α-还原酶活性均表现出一定的抑制作用，且具有出明显的剂量效应关系，随受试液质量浓度升高其抑制率也随之升高。在100 mg/mL质量浓度下，抑制率达到52.74%，阳性对照非那雄胺(0.05 mg/L)表现出极高的抑制率(91.47%)，因为非那雄胺是一种公认的5α-还原酶的竞争型抑制剂。结果见图2。

图2 样品对 5α-还原酶的抑制效果Fig. 2 Inhibition of 5α-reductase activity

有相关研究表明，现有脱发人群中约九成属于雄激素源性脱发。阳性对照药物非那雄胺为一种甾体类固醇，其作为II型5α-还原酶抑制剂可以有效抑制血液循环，抑制头部皮肤毛囊内睾酮向二氢睾酮转换这一过程，从而达到治疗脱发的目的，是目前国内外治疗雄激素源脱发的一线用药[2,7]。

体外试验结果表明，受试液样品在4、20、40、100 mg/mL质量浓度下对5α-还原酶活性均具有抑制作用，抑制率分别为6.86%、14.39%、22.51%和52.74%。虽然效果不如阳性对照非那雄胺显著，但在100 mg/mL质量浓度下抑制率也能超过50%，可推测本受试液在体外也具有抑制雄性激素脱发的作用。

2.3 小鼠防脱发试验

2.3.1 一般状态观察

造模组小鼠注射丙酸睾酮溶液后，有些小鼠出现躁动现象并互相厮打。2 w后，小鼠毛发顺滑程度下降；4～5 w后，小鼠背部毛发逐渐干枯失去光泽，7 w左右小鼠逐渐出现背部毛发脱落现象。侧柏叶、何首乌复合提取物溶液高、中剂量组比模型组脱落现象有改善，尤以高剂量组较为明显。各组小鼠毛发脱落情况比较见图3及表1。

图3 各组小鼠实验照片Fig. 3 Mice anti-hair loss experiment photos注：a-正常组，b-模型组，c-阳性组，d-低剂量组，e-中剂量组，f-高剂量组

2.3.2 血清睾酮、雌二醇

测定结果见表2。

表1 小鼠脱毛重量

表2 小鼠血清 T、E2 含量

雄激素在毛发生长过程中起到重要作用，能够促进毛发由新生状态向成熟状态转化。已有研究指出，雄激素如果异常增多，会导致 T /E2 比例失调，从而导致雄激素源性脱发(AGA )疾病的发生[17]。通过本试验研究，发现该复合提取物可降低体内睾酮含量，这与其具有抑制5α-还原酶活性也符合，提示了其可能的作用机理，进而推测该复合提取物应用于人体也具有防脱作用。

AGA发病率较高且发病机制仍未完全明确，本试验采用的AGA鼠类模型，是目前较受认可的一个动物模型，具有较明显的优势。其一，该造模过程与AGA的病理生化改变过程相似。其二，小鼠基因组与人类高度接近，毛发生长变化周期与人类也相似[18]；其三，C57BL/6J 小鼠毛发黑色，其颜色变化有利于判断毛发的生长状态，为动物实验最常用的小鼠品系之一[19]。本试验采用这种小鼠模型，结果表明侧柏叶、何首乌复合提取物能明显改善小鼠的脱发现象。

本团队的早期试验结果表明侧柏叶醇提物和挥发油可以适当延缓脱毛，对小鼠化疗性毛囊损伤具有一定的保护作用并能有效改善其脱发现象[5]；还有相关研究则表明侧柏叶醇提物对防治脂溢性脱发也具有一定的效果[20]，而本试验结果则表明侧柏叶、何首乌复合醇提取物具有明显的5α-还原酶抑制活性，能显著改善小鼠雄激素源性脱发。

3 结 论

本文采用体外和体内试验对侧柏叶、何首乌复合醇提取物的防脱发功效进行评价，试验证明了该复合提取物具有清除DPPH自由基从而起到抗氧化的作用；在体外具有抑制5α-还原酶活性，且AGA小鼠模型试验表明其可以显著改善 C57BL/6小鼠雄激素源性脱发现象。

采用中国传统药用植物治疗脱发具有全面兼顾、副作用小、消费者接受程度高等优势；本试验通过体外和体内试验结果充分证明了侧柏叶、何首乌复合醇提取物具有明确的防治雄激素源性脱发功效，且提示了其发挥作用的可能机理与抑制5α-还原酶活性有关。该提取物可应用于研发更安全更有效的防脱生发相关个人护理类日化产品，具有广阔的市场前景。