叶酸和维生素B12对产蛋鸡生产性能、小肠屏障功能及相关基因表达的影响

武笑天 温 曌 李锐瑞 白 彦 王 瑞 杨 玉

(山西农业大学动物科学学院，太谷 030801)

叶酸又名蝶酰谷氨酸，是畜禽生长发育过程中一种重要的水溶性B族维生素。作为一碳单位的受体和供体，叶酸参与动物机体DNA、RNA及各种蛋白质的合成[1]，能够影响细胞因子的形成，进而提高动物机体的免疫力。维生素B12可以以辅酶的形式提高叶酸的利用率，促进碳水化合物、脂肪和蛋白质的代谢[2]。肠道作为营养物质吸收的主要场所，其健康发育对家禽生长至关重要。而家禽肠道健康与肠道黏膜屏障功能密切相关。尹秀玲等[3]研究表明，饲粮添加0.4、0.5、0.6和1.0 mg/kg叶酸时，雏鸡的体重随之增加，而叶酸缺乏可引起雏鸡免疫力下降，死亡率提高。丑武江等[4]研究表明，饲粮添加3 mg/kg叶酸可显著提高肉仔鸡的平均日增重和平均日采食量，提高血清中蛋白质的含量，降低料重比。饲粮添加10 mg/kg维生素B12显著提高了5～15周龄五龙鹅空肠绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度(V/C)值，显著降低了空肠隐窝深度[5]。3周龄肉仔鸡饲粮中分别添加0.75 mg/kg叶酸和300 mg/kg甜菜碱以及2.25 mg/kg叶酸和300 mg/kg甜菜碱，肉仔鸡饲料转化率和平均日增重均随着叶酸添加水平的提高而提高[6]。京红蛋鸡营养标准中叶酸和维生素B12的推荐量分别为1.5 mg/kg和25～30 μg/kg。有关叶酸和维生素B12缺乏的研究较多，而补充多少叶酸和维生素B12可获得较好的肠道免疫性能，仍处于空白。因此，本试验在饲粮中添加不同水平的叶酸和维生素B12，研究其对产蛋高峰期京红蛋鸡生产性能、蛋品质、小肠屏障功能及相关基因表达的影响，为调控产蛋鸡免疫性能提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计和饲粮

试验选择972只28周龄健康状况良好、处于产蛋高峰期的京红蛋鸡，随机分成9组，每组6个重复，每个重复18只鸡。采用2因素3水平试验设计，在基础饲粮中分别添加0、2和5 mg/kg叶酸和0、25和75 μg/kg维生素B12，基础饲粮组成及营养水平见表1，试验设计见表2。维生素B12由河北某生物工程股份有限公司提供，其有效成分含量≥1%；叶酸由河北某生物科技有限公司提供，其有效成分为95.5%～102.0%。试验预试期2周，饲喂基础饲粮，期间各组蛋鸡产蛋率无显著差异(P>0.05)后开始试验，正试期8周。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

表2 试验设计

1.2 饲养管理

采用3层阶梯式笼养，每笼3只鸡，连续的6笼为1个重复，各重复均匀分布于鸡舍同行中间2层。全程粉料饲养，每天光照时间为16 h，鸡舍温度控制在25 ℃左右，自由饮水，每天喂食2次(09:00和15:00)，自然通风和纵向负压通风相结合，每天16:30拣蛋并记录称重。其他均按养殖场常规方法进行。

1.3 样品采集处理和指标测定

1.3.1 生产性能

试验期间以各重复为单位记录每日采食量、产蛋总数、总蛋重、软破蛋数和死淘数，每周计算各组的料蛋比和产蛋率。

1.3.2 蛋品质

试验期间，每周每个重复选取3枚接近平均蛋重的鸡蛋(n=18)，测定蛋形指数、蛋壳强度、蛋壳厚度、蛋黄颜色、哈氏单位、蛋白高度、平均蛋重、蛋黄重及蛋壳重。所用仪器为全自动蛋品分析仪(EA-01,以色列)、ORKA蛋壳强度仪(EFO-501,以色列)、蛋壳厚度仪(MODEL-1061,日本)和数显千分尺(MODEL-P-1)。

1.3.3 小肠组织形态

试验结束时，每重复选取1只鸡，每组6只鸡，禁食12 h，采用无菌操作分别取十二指肠、空肠和回肠的同一部位放于75%的中性甲醛中，在4 ℃环境中保存。按照常规方法制作石蜡切片，利用Image-Pro Plus软件测量小肠各部位绒毛高度和隐窝深度，并计算V/C值。每个样本观察2个非连续切片，每张切片选取3个视野，每个视野分别测定10组数据，其平均值作为1个测定数据。

1.3.4 小肠总RNA提取和反转录

鸡颈静脉放血致死，采用无菌操作迅速取出十二指肠、空肠和回肠同一部位放入液氮中，置于-80 ℃待测。采用Trizol法分别提取十二指肠、空肠和回肠组织总RNA。用核酸蛋白仪测定RNA完整性、浓度和纯度。按照反转录试剂盒说明合成cDNA，-20 ℃保存备用。

1.3.5 引物设计

根据NCBI测序数据库中闭锁蛋白(occludin)、闭合蛋白-1(claudin-1)、闭合小环蛋白-1(ZO-1)、黏蛋白2(MUC2)、Toll样受体4(TLR4)、核转录因子-κB(NF-κB)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-10(IL-10)和白细胞介素-13(IL-13)基因的mRNA序列，以β-肌动蛋白(β-actin)基因作为内参基因，用Primer-BLAST设计上述引物(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列见表3。

表3 引物序列

1.3.6 实时荧光定量PCR

以合成的cDNA为模板，按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒说明，在实时荧光定量PCR仪上进行，反应条件为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，共40个循环。采用相对定量分析法，以β-actin作为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算目的基因mRNA相对表达量。

1.4 数据处理和统计分析

试验数据经Excel 2010初步整理后，应用SAS 9.2软件中的一般线性模型(GLM)程序按试验设计对数据进行方差分析，以重复为试验单元，模型的主要效应包括叶酸、维生素B12处理以及二者之间的互作效应。F检验显著差异者，以最小显著差异(LSD)法比较平均值间的差异显著性。结果以平均值和均值标准误(SEM)表示。P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 叶酸和维生素B12对产蛋高峰期京红蛋鸡生产性能的影响

由表4可知，饲粮添加不同水平的叶酸和维生素B12及其互作效应对产蛋高峰期京红蛋鸡的平均日采食量、平均蛋重、料蛋比和产蛋率均无显著影响(P>0.05)。

表4 叶酸和维生素B12对产蛋高峰期京红蛋鸡生产性能的影响

2.2 叶酸和维生素B12对产蛋高峰期京红蛋鸡蛋品质的影响

由表5可知，饲粮添加叶酸对产蛋高峰期京红蛋鸡蛋形指数、蛋壳厚度、哈氏单位和蛋壳比率有显著影响(P<0.05)，饲粮添加维生素B12对蛋壳厚度和哈氏单位有显著影响(P<0.05)。叶酸和维生素B12的互作效应除对哈氏单位有显著影响(P<0.05)外，对其余指标均无显著影响(P>0.05)。各叶酸或维生素B12添加组(Ⅱ～Ⅸ组)哈氏单位均显著高于未添加组(Ⅰ组)(P<0.05)，且以Ⅴ组(添加2 mg/kg叶酸+25 μg/kg维生素B12)最高。

表5 叶酸和维生素B12对产蛋高峰期京红蛋鸡蛋品质的影响

2.3 叶酸和维生素B12对产蛋高峰期京红蛋鸡小肠组织形态的影响

由表6可知，饲粮添加叶酸对产蛋高峰期京红蛋鸡空肠和回肠绒毛高度和V/C值均有显著影响(P<0.05)，饲粮添加维生素B12对十二指肠和回肠绒毛高度和V/C值有显著影响(P<0.05)，叶酸和维生素B12的互作效应对十二指肠和空肠绒毛高度和V/C值有显著影响(P<0.05)。Ⅱ组、Ⅳ组、Ⅴ组和Ⅷ组十二指肠绒毛高度显著高于Ⅰ组(P<0.05)，Ⅴ组十二指肠V/C值显著高于Ⅰ组和Ⅶ组(P<0.05)；Ⅴ组空肠绒毛高度和V/C值显著高于Ⅰ组和Ⅱ组(P<0.05)。结果表明，Ⅴ组蛋鸡小肠组织形态得到改善，小肠吸收能力得以增强。

表6 叶酸和维生素B12对产蛋高峰期京红蛋鸡小肠组织形态的影响

2.4 叶酸和维生素B12对产蛋高峰期京红蛋鸡小肠屏障功能相关基因表达的影响

由表7可知，饲粮添加叶酸、维生素B12及其互作效应能显著提高产蛋高峰期京红蛋鸡十二指肠occludin、claudin-1、ZO-1和MUC2 mRNA相对表达量(P<0.05)。Ⅴ组十二指肠occludin、ZO-1 mRNA相对表达量均显著高于Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅶ组和Ⅸ组(P<0.05)，Ⅵ组十二指肠claudin-1 mRNA相对表达量显著高于除Ⅴ组外的其他组(P<0.05)，Ⅴ组十二指肠MUC2 mRNA相对表达量显著高于除Ⅵ组外的其他组(P<0.05)，Ⅷ组十二指肠MUC2 mRNA相对表达量显著高于Ⅰ组(P<0.05)。

表7 叶酸和维生素B12对产蛋高峰期京红蛋鸡小肠屏障功能相关基因表达的影响

饲粮添加叶酸对空肠occludin、claudin-1和MUC2 mRNA相对表达量有显著影响(P<0.05)，对ZO-1 mRNA相对表达量无显著影响(P>0.05)；饲粮添加维生素B12仅对空肠MUC2 mRNA相对表达量有显著影响(P<0.05)；叶酸和维生素B12的互作效应对空肠occludin、ZO-1和MUC2 mRNA相对表达量有显著影响(P<0.05)。Ⅴ组空肠occludin mRNA相对表达量显著高于Ⅰ组和Ⅸ组(P<0.05)，Ⅲ组空肠ZO-1 mRNA相对表达量显著高于Ⅰ组(P<0.05)，Ⅴ组空肠MUC2 mRNA相对表达量显著高于其他组(P<0.05)。

饲粮添加叶酸仅对回肠occludin mRNA相对表达量有显著影响(P<0.05)；饲粮添加维生素B12对回肠occludin和MUC2 mRNA相对表达量有显著影响(P<0.05)；叶酸和维生素B12的互作效应对回肠occludin和MUC2 mRNA相对表达量有显著影响(P<0.05)。Ⅴ组和Ⅵ组回肠occludin mRNA相对表达量显著高于其他各组(P<0.05)，Ⅵ组回肠MUC2 mRNA相对表达量显著高于Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅳ组和Ⅸ组(P<0.05)。

2.5 叶酸和维生素B12对产蛋高峰期京红蛋鸡小肠炎症相关基因表达的影响

由表8可知，除饲粮添加维生素B12对产蛋高峰期京红蛋鸡十二指肠IL-13 mRNA相对表达量无显著影响(P>0.05)外，饲粮添加叶酸和维生素B12对十二指肠炎症相关基因表达均有显著影响(P<0.05)；叶酸和维生素B12的互作效应对十二指肠TLR4、NF-κB、IL-1β和IL-10 mRNA相对表达量有显著影响(P<0.05)。除Ⅱ组十二指肠NF-κBmRNA相对表达量与Ⅰ组无显著差异(P>0.05)外，Ⅱ～Ⅸ组十二指肠TLR4、NF-κB、TNF-α和IL-1βmRNA相对表达量均显著低于Ⅰ组(P<0.05)，Ⅱ组、Ⅴ组和Ⅵ组十二指肠IL-10 mRNA相对表达量显著高于Ⅰ组(P<0.05)。

表8 叶酸和维生素B12对产蛋高峰期京红蛋鸡小肠炎症相关基因表达的影响

除饲粮添加维生素B12对空肠IL-1βmRNA相对表达量无显著影响(P>0.05)外，饲粮添加叶酸和维生素B12对空肠炎症相关基因表达均有显著影响(P<0.05)；叶酸和维生素B12的互作效应对空肠TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β和IL-10 mRNA相对表达量均有显著影响(P<0.05)。Ⅴ组空肠TLR4 mRNA相对表达量显著低于Ⅸ组(P<0.05)，Ⅱ～Ⅸ组空肠NF-κBmRNA相对表达量显著低于Ⅰ组(P<0.05)，Ⅰ组和Ⅲ组空肠TNF-αmRNA相对表达量显著高于Ⅳ组、Ⅴ组、Ⅵ组和Ⅶ组(P<0.05)，除Ⅲ组外，其他各添加组空肠IL-1βmRNA相对表达量均显著低于Ⅰ组(P<0.05)，Ⅴ组空肠IL-10 mRNA相对表达量显著高于其他各组(P<0.05)。

饲粮添加叶酸除对回肠IL-1β和IL-10 mRNA相对表达量无显著影响(P>0.05)外，对其他指标均有显著影响(P<0.05)；饲粮添加维生素B12对回肠TLR4、TNF-α、IL-10和IL-13 mRNA相对表达量均有显著影响(P<0.05)；叶酸和维生素B12的互作效应对回肠TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-13 mRNA相对表达量均无显著影响(P<0.05)。

3 讨 论

3.1 叶酸和维生素B12对产蛋高峰期京红蛋鸡生产性能的影响

叶酸是水溶性B族维生素，维生素B12作为一碳代谢的辅酶，两者都可以做为氨基酸互变中一碳集团的载体参与蛋白质的生物合成，对生命早期的生长发育非常重要[7]。雏鸡缺乏叶酸会出现生长不良，羽毛生长凌乱、色泽不佳，贫血及骨粗短症以及免疫功能低下等症状；缺乏维生素B12则可能表现为厌食、生长不良和贫血等。李轶伟等[8]研究表明，肉鸡基础饲粮中添加叶酸可显著提高其平均日增重，且以3 mg/kg叶酸添加组效果最好。薛安永等[9]研究表明，饲粮添加1.64 mg/kg叶酸能显著提高8周龄肉鸡平均日采食量和平均日增重。Jing等[10]研究表明，在小麦-豆粕型饲粮中添加4 mg/kg叶酸饲喂24周龄蛋鸡8周显著提高了其蛋重和日产蛋重。Bagheri等[11]研究表明，饲粮添加叶酸能够显著提高52～58周龄蛋鸡的产蛋率和平均蛋重。但也有研究表明，饲粮添加叶酸对蛋鸡的生产性能无显著影响[12-17]，这与本试验研究结果一致。

3.2 叶酸和维生素B12对产蛋高峰期京红蛋鸡蛋品质的影响

评价蛋品质的常规指标包括蛋形指数、蛋壳强度、蛋壳厚度、蛋黄颜色、哈氏单位和蛋白高度等。叶酸以四氢叶酸形式参与蛋氨酸、组氨酸及丝氨酸等氨基酸代谢，维生素B12可使叶酸转变为四氢叶酸，从而提高叶酸的利用率[18]。而蛋氨酸又是家禽玉米-豆粕型饲粮中的第一限制性氨基酸，其代谢直接影响蛋鸡的生产性能及蛋壳质量。El-Husseiny等[19]研究表明，叶酸、维生素B12和蛋氨酸的互作效应可显著增加28～43周龄白羽蛋鸡蛋壳比重，但对蛋壳厚度无显著影响。叶酸和维生素B12的添加可改善33周龄蛋鸡的蛋壳强度，其中0.5 mg/kg叶酸+0.01 mg/kg维生素B12组蛋壳强度最大为4.2 kg/cm2，比对照组提高了17.32%[20]。本试验中，饲粮添加叶酸显著提高了蛋鸡的蛋形指数和蛋壳厚度；叶酸和维生素B12互作效应显著提高了鸡蛋哈氏单位，且当添加2 mg/kg叶酸和25 μg/kg维生素B12时，哈氏单位最高。而哈氏单位越高，表明鸡蛋蛋白品质越好，这也说明饲粮添加叶酸和维生素B12后，鸡蛋哈氏单位得到了改善。

3.3 叶酸和维生素B12对产蛋高峰期京红蛋鸡小肠组织形态的影响

家禽叶酸的主要吸收位点是十二指肠和空肠。肠道作为营养物质吸收的主要场所，其健康发育对家禽生长至关重要。肠道绒毛高度、隐窝深度及V/C值能反映肠道健康情况。肠黏膜组织结构的完整性是衡量肠免疫功能的重要指标[21]。绒毛的发育程度不仅反映肠黏膜结构的完整性，而且决定了机体对营养物质的吸收能力。绒毛越长，肠道与营养物质的接触面积越大，营养物质的吸收就越好[22]；隐窝深度异常加深与增生，可能意味着肠黏膜发生病变[23]，因此V/C值能够反映肠黏膜形态结构及功能的整体状况[24]。本试验结果发现，饲粮添加2 mg/kg叶酸和25 μg/kg维生素B12时，产蛋鸡十二指肠和空肠绒毛高度和V/C值均显著高于未添加组，且料蛋比降低、产蛋率提高，说明添加适量的叶酸和维生素B12可改善肠道黏膜组织形态，促进肠道对营养物质的吸收。

3.4 叶酸和维生素B12对产蛋高峰期京红蛋鸡小肠屏障功能相关基因表达的影响

肠道黏膜屏障功能和结构的完整性对维持家禽肠道健康和生产具有重要的意义。完整的肠道黏膜屏障包括机械屏障、化学屏障、免疫屏障和微生物屏障[25]。机械屏障是由肠黏膜上皮细胞、细胞间紧密连接等结构组成，是肠道屏障中尤为重要的一部分。紧密连接是由若干种特定功能蛋白所组成，其中occludin、claudin-1和ZO-1是3种关键的蛋白组分[26]。研究发现，occludin、claudin-1和ZO-1减少会增加肠道通透性，因此在肠道紧密连接屏障中发挥着重要作用[27]。化学屏障主要是指覆盖在肠上皮细胞的黏液层。黏液层是机体抵御肠道病原微生物入侵的第1道防线，MUC2是由杯状细胞分泌，是形成小肠黏液层的主要黏蛋白，因此MUC2表达量是作为评价肠道健康状态的重要指标之一[28]。MUC2构成的凝胶黏液层结构牢固并保持高度稳定性，能够有效地保护肠上皮细胞和发挥屏障保护作用[29]。叶酸与维生素B12联合应用的研究常见于医学报道，而在家禽营养学上的研究基本处于空白。本试验结果表明，饲粮添加2 mg/kg叶酸和25 μg/kg维生素B12使得产蛋鸡十二指肠和空肠occludin和MUC2 mRNA相对表达量显著提高，这说明饲粮添加2 mg/kg叶酸和25 μg/kg维生素B12可降低家禽肠道通透性，抵制病原微生物入侵，阻止细菌在肠黏膜表面黏附，进而提高十二指肠和空肠对营养物质的吸收率，这与本试验发现饲粮添加2 mg/kg叶酸和25 μg/kg维生素B12显著提高十二指肠和空肠绒毛高度和V/C值的结果相一致。因此我们推测叶酸和维生素B12可能通过影响V/C值、肠道紧密连接蛋白以及MUC2表达的方式来维持和改善肠道物理和化学屏障功能，促进肠道对营养物质的消化吸收。

3.5 叶酸和维生素B12对产蛋高峰期京红蛋鸡小肠炎症相关基因表达的影响

肠道免疫屏障主要由肠道淋巴组织及免疫细胞构成，通过分泌免疫球蛋白、细胞因子和干扰素等维持肠道稳态。硏究发现，TLR4与肠上皮细胞屏障完整性相关。TLR4在肠黏膜炎性疾病中调控炎性发展，并且TLR4的表达水平会上升[30]。TLR4基因表达可影响下游信号通路促炎细胞因子TNF-α和IL-1β的产生。肠道TNF-α、IL-1β能够引起炎性介质释放，参与肠道炎性疾病的发展过程。抗炎性细胞因子IL-10和IL-13能够在体内抑制活化的T细胞产生炎性细胞因子，抑制炎症反应的发生。叶酸和维生素B12缺乏将导致白细胞数量减少，淋巴细胞功能损害，进而影响体液免疫，造成中性粒细胞杀菌能力下降[31]。高庆[32]研究表明，饲粮添加适宜剂量的叶酸可明显改善机体免疫机能，提高仔猪抗病毒的能力。Abd Allah等[33]研究表明，饲粮添加叶酸可以降低小鼠肝脏炎症因子NF-κB和IL-1β的表达。本试验结果表明，饲粮添加2 mg/kg叶酸和25 μg/kg维生素B12显著降低十二指肠和空肠TLR4、TNF-α和IL-1βmRNA相对表达量，显著降低下游转录因子NF-κBmRNA相对表达量，从而减少了肠道炎性疾病的发生，说明饲粮添加2 mg/kg叶酸和25 μg/kg维生素B12对该段肠道健康有正向调节作用。但在回肠中，叶酸和维生素B12互作效应对TNF-α和IL-1βmRNA相对表达量未产生显著影响，说明叶酸和维生素B12互作效应在不同肠道间存在一定的差异性。这可能与叶酸在十二指肠和空肠中吸收有关。本试验同时发现，饲粮添加2 mg/kg叶酸和25 μg/kg维生素B12能够提高十二指肠和空肠IL-10 mRNA相对表达量，说明叶酸和维生素B12互作可以通过增强体液免疫，维护肠道健康。

4 结 论

饲粮添加适宜水平的叶酸和维生素B12可提高产蛋高峰期京红蛋鸡鸡蛋的哈氏单位，改善十二指肠和空肠的组织形态，上调十二指肠和空肠occludin、ZO-1、MUC2和IL-10 mRNA的表达，下调十二指肠和空肠NF-κB、TLR4及其下游信号通路TNF-α和IL-1βmRNA的表达，进而增强肠道免疫功能。本试验中，以饲粮(含1.35 mg/kg叶酸和25 μg/kg维生素B12)添加2 mg/kg叶酸和25 μg/kg维生素B12效果较好。